Name: efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

XHP har fått stöd av National Institute of Health (NIH) anslag från National Institute on Aging (NIHK01AG024496) och The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development (NIHR21HD056530).

1. Lösning och Media förberedelse <ol><li> Gelatin beläggning lösning: 0,1% (w / v) gelatinfolier DDH 2 O, autoklaveras och förvara vid 4 ° C. </li><li> Matrigel beläggning lösningar. Stamlösning: långsam upptining Matrigel (10 ml) vid 4 ° C över natten, tillsätt 10 ml iskall DMEM eller DMEM/F12, blanda väl och delprov 1 ml / rör under steriliseras vävnadsodling huva, förvara vid -20 ° C. Arbetslösning: långsam upptining 1 ml Matrigel alikvot vid 4 ° C i 1-2 timmar, transfer till 14 ml kyld DMEM eller DMEM/F12 och blanda väl under steriliseras vävnadsodling huva omedelbart före beläggning. </li><li> Mänskliga laminin beläggning lösning: Späd 1 ml humant laminin lösning (0,5 mg / ml i Tris buffrat NaCl, förvara vid -80 ° C, sakta tina i 4 ° C i 1-2 timmar) med iskall DMEM eller DMEM/F12 till 12,5 ml brukslösning (40 mikrogram / ml) under steriliserade vävnadsodling huva omedelbart före beläggning. </li><li> Tillväxtfaktor stamlösningar (500-1000X): lös tillväxtfaktor vid 10 mikrogram/ Ml steriliserade buffert (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glycerol, 1XPBS) och lagrar som 50-100 l / rör alikvoter vid -80 ° C. </li><li> HESC media: DMEM/F12 eller KO-DMEM (80%), KO serum ersättning (20%), L-Alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MEM onödiga aminosyror (MNAA, 1X), och β-Mercaptoethanol (100 M), filtreras och lagras vid 4 ° C, kompletterat med 20 ng / ml bFGF före användning. Eller byta ut &quot;KO serum byte&quot; med definierade komponenter: DMEM/F12 eller KO-DMEM (100%), L-Alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM essentiella aminosyror (MEAA , 1X) och β-Mercaptoethanol (100 M), filtreras och lagras vid 4 ° C, kompletterat med bFGF (20 ng / ml), humant insulin (20 mikrogram / ml), askorbinsyra (50 mikrogram / ml), mänskliga Activin A (50 ng / ml), humant albumin / Albumax (10 mg / ml), och mänskliga transferrin (8 mikrogram / ml) före användning. </li><li> HESC hjärt differentiering media: DMEM/F12 (90%), definierad FBS (10%), och L-Alanyl-L-GLN eller L-GLN (2 mm). </li><li> Media innehåller nikotinamid (NAM): Lägg till NAM för att hESC media eller hESC hjärt media differentiering till slutlig koncentration av 10 mm, filtreras, förvara vid 4 ° C och använd inom 2 veckor av förberedelser. </li></ol> 2. Plate Beläggning <ol><li> Coat plattor med gelatin: Lägg till 2,5 ml / brunn av gelatin lösning till 6 brunnar och inkubera över natten i ett 37 ° C fuktig kuvös. </li><li> Coat plattor med laminin: chill gelatin-plåt och ta bort gelatin, tillsätt 2,5 ml / brunn Matrigel eller mänskliga laminin beläggning fungerande lösning till redan kylda gelatiniserad 6-brunnar och inkubera vid 4 ° C över natten. </li></ol> 3. Passaging och såmaskiner diverse hESCs fastställda villkor <ol><li> Låt hESC kolonier växa till 5-7 dagar gammal, och ta plattan hESC kultur att dissekera mikroskop (förvärma dissekera steg till 37 ° C) under dissekera steriliserade huva. </li><li> Välj hESC kolonier ska delas. Morfologiskt bör dessa kolonier har&gt; 75% odifferentierade hESCs (SMalla kompakta celler), vanligen något ogenomskinlig (inte vit-uppstaplade celler, inte klart differentierade celler) med definierade kanter under dissekera mikroskop. Noggrant beskriva de utvalda kolonierna och ta bort differentierade fibroblast skikt som omger kolonin och alla differentierade delar (om någon) av kolonin med kanten av P2 steril pipettspetsen eller dras glas kapillär. </li><li> Ta bort den gamla medierna som innehåller flytande loss differentierade celler genom att aspirera. Tvätta med hESC medier (utan bFGF) en gång. Tillsätt 3 ml / brunn färska media hESC innehållande 20 ng / ml bFGF. </li><li> Skär den odifferentierade hESC kolonierna i små bitar, och ta med sterila pipetten eller dras glas kapillär. </li><li> Pool media innehåller friliggande kolonin ihop i en 50 ml koniska rör. Tvätta plattan en gång med 1 ml / brunn media hESC innehållande 20 ng / ml bFGF och pool tillsammans. </li><li> Aspirera Matrigel eller mänskliga laminin lösning från belagd färska plattorna. Alikvotera 4 ml / brunn hESK media som innehåller koloni bitar till en 6-brunnar. Försiktigt överföra plattan till inkubatorn utan att skaka och låt koloni stycken frön över natten utan att störa i en fuktig 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO 2. </li></ol> 4. Hjärtat Induktion av hESCs under definierade kultur-system med Nikotinamid <ol><li> Dag 3 efter sådd, bort det mesta av gamla medier från varje brunn i plattan och lämna tillräckligt media för att hESC kolonier att vara nedsänkt (aldrig tillåta hESCs torka ut). Ersätt med 4 ml / brunn färska hESC media som innehåller 20 ng / ml bFGF och 10 mM nikotinamid (NAM). </li><li> Byt ut gamla medier med färska hESC media som innehåller 20 ng / ml bFGF och 10 mM NAM varannan dag, och tillåta hjärt-inducerad hESC kolonier växa till dag 8-10. När utsätta till NAM kommer alla celler i kolonin genomgå morfologi förändringar till stora differentierade celler som kommer att fortsätta att föröka sig. Kolonierna kommer att öka i storlek, och dag 8-10, end celler börjar hopa sig i vissa områden av kolonierna. </li></ol> 5. Fortsatta Hjärtat Differentiering i suspension Kultur <ol><li> Ta tallrik hESC kultur att dissekera mikroskop (förvärma dissekera steg till 37 ° C) under dissekera steriliserade huva. Försiktigt beskriva kolonierna och ta bort fibroblast skikt som omger kolonin (differentierade celler migrerat ut från kolonin) med kanten av P2 steril pipettspetsen eller dras glas kapillär. </li><li> Ta bort den gamla medierna som innehåller flytande loss fibroblast celler genom aspirera. Tvätta med hESC medier (utan bFGF) en gång. Tillsätt 3 ml / brunn färska medier hESC (utan bFGF). </li><li> Skär hjärt-inducerad hESC kolonier i små bitar, och ta med sterila pipetten eller dras glas kapillär. </li><li> Pool media innehåller friliggande kolonin ihop i en 50 ml koniska rör. Tvätta plattan en gång med 1 ml / brunn media hESC (utan bFGF) och pool tillsammans. </li><li> Alikvotera 4 ml / brunn serumfritt hESC media som innehåller koloni bitar till en 6-väl ultralåga fästplatta och inkubera vid 37 ° C fuktas inkubator att tillåta flytande cellulär kluster (cardioblasts) för att bilda i 4-5 dagar. </li></ol> 6. Slå Cardiomyocyte Fenotyp mognad i Självhäftande Kultur <ol><li> Pool media som innehåller flytande cardioblasts tillsammans i en 50 ml koniska rör. Centrifugera vid 1400 rpm i 5 min. Sug den gamla media så mycket du kan och lägga lika mycket färska hESC hjärt differentiering medier innehållande 10 mM NAM. </li><li> Pipettera upp och ner för att blanda flytande cardioblasts och delprov 4 ml / brunn till 6-bra plattor. Överför plattorna till 37 ° C fuktas inkubator för att cardioblasts att fästa över natten. </li><li> Byt hESC hjärt differentiering medier innehållande 10 mM NAM varannan dag. </li><li> Dag 8, ersätt med hESC hjärt differentiering media utan NAM, och fortsätter att ersätta hESC hjärt differentiering media emycket häromdagen. Slå cardiomyocytes kommer att börja visas i ca 1-2 veckors kontinuerlig odling efter utsättande av NAM och öka i antal med tiden, och kunde behålla starka och rytmiska sammandragningar i över 3 månader. </li></ol> 7. Representativa resultat: Nikotinamid (NAM) återges tillräckligt för att framkalla hESCs upprätthålls i definierade kultur för att övergången från pluripotens uteslutande till en cardiomesodermal fenotyp (Fig. 2B). Vid exponering av odifferentierade hESCs till NAM kommer alla celler i kolonin genomgå morfologi ändras till stora differentierade celler som nedreglera uttrycket av oktober-4 och börja uttrycka hjärtats specifika transkriptionsfaktor (CSX) Nkx2.5 och α- actinin, i överensstämmelse med en cardiomesoderm fenotyp (Fig. 2B). Dessa differentierade celler kommer att fortsätta att föröka sig och kolonierna öka i storlek. Ökad intensitet Nkx2.5 kommerkan observeras vanligtvis i områden i kolonierna där cellerna börjar stapla upp (Fig. 2B). Efter lossnat kommer NAM-behandlade hESCs bilda flytande cellulär kluster (cardioblasts) i en suspension kultur att fortsätta hjärt differentiering processen. Efter tillåter cardioblasts att fästa och fortsätta att behandla med NAM under 1 vecka, kommer att slå cardiomyocytes börja visas i cirka 1-2 veckor av kontinuerlig odling efter utsättande av NAM med en drastisk ökning i effektivitet jämfört med spontan flera härstamning differentiering av hESCs utan behandling under samma period (Fig. 2C). Celler inom slå cardiomyocyte kluster kommer att uttrycka markörer kännetecknar cardiomyocytes, inklusive Nkx2.5 och α-actinin (Fig. 2C). Sammandragningar av att slå cardiomyocytes bekräftades av elektriska profiler att vara starka, rytmiska, väl samordnade och väl fångas, med regelbundna impulser påminner om pQRS-T-komplex sett från elektroder kroppsyta i kliniska elektrokardiogram (Fig. 2C, även se videon). Den cardiomyocytes kunde behålla sin starka kontraktilitet i över 3 månader. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Figur 1. Övergripande system för konventionella sättet kontra små molekyler-induktion metod för differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller mot specialiserade funktionella celler. (A) En schematisk av konventionella sättet att använda flera härstamning lutning på mänskliga pluripotenta stamceller genom spontan groddar lager differentiering. (B) En schematisk av de välkontrollerade effektiv induktion av mänskliga pluripotenta stamceller enbart till ett visst kliniskt relevant härstamning genom en enkel tillhandahållande av små molekyler. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Figur 2. Nikotinamid inducerar hjärt härstamning specifikation direkt i pluripotens under bestämda förhållanden och utveckling mot att slå cardiomyocytes. (A) Schematisk skildrar i protokollet tiden raden av riktade hjärt differentiering av hESCs. (B) vid exponering av odifferentierade hESCs till Nikotinamid (NAM) under definierade kultur-systemet, stora differentierade oktober-4 (röd) negativ celler i kolonin började dyka upp, jämfört med mock-behandlade (DMSO) hESCs som kontroll. NAM-inducerad oktober-4-negativa celler började uttrycka Nkx2.5 (grön) och α-actinin (röd), i linje med tidig hjärt-differentiering. Gradvis ökat intensiteten i Nkx2.5 var observeras vanligtvis i områden i kolonin där celler började stapla upp. Alla celler markeras med DAPI färgning av sina kärnor (blå). (C) NAM-inducerade hjärt-engagerade hESCs gav slå cardiomyocytes med en drastisk ökning av effektiviteten, mätt med det cellulära klustergor som visade rytmiska sammandragningar (se elektrofysiologiska profil och videor) och immunopositive för Nkx2.5 (grön) och α-actinin (röd). Fas bilder av representativa stora kluster slå cardiomyocyte och högre bilder makt representativa upphandlande hjärt muskler visas (se även motsvarande videor). Pilarna visar den stora kluster slå cardiomyocyte används för elektrofysiologiska inspelning. Elektrofysiologiska profil slå cardiomyocytes visar regelbunden, fångas, rytmiska impulser påminner om p-QRS-T-komplex observerats i kliniska EKG. Skala staplar: 0,1 mm. Videor: Upphandlande cardiomyocytes skiljas från NAM-inducerad hESCs. Videos 1 och 2 visar representativa stora slå cardiomyocyte kluster i ca 1 och 3 månad efter fastsättning. Video 3 och 4 visar representativa upphandlande hjärt muskler vid högre effekt. Video 5 visar en typical mindre slå cardiomyocyte kluster differentierade spontant från hESCs utan NAM behandling som kontroll. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Klicka här för att se på video 1.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Klicka här för att titta på video 2.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Klicka här för att titta på video 3.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Klicka här för att titta på video 4.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Klicka här för att se video 5.</a>

<ol>
	<li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+tissue+engineering:+a+review.">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li><li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart.">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li><li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair.">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li><li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li><li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li><li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+transcription+factor+Csx/Nkx2-5:+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases.">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li><li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li><li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy.">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Författarna förklarar konkurrerande intressen. XHP är grundare av Xcelthera. XHP och EYS har intellektuella egenskaper relaterade till hESCs.

En av de stora utmaningar för både utvecklingsstudie och kliniska översättningen har varit att kanalisera de breda differentiering potential pluripotenta mänskliga stamceller till önskad fenotyp effektivt och förutsägbart. Även om sådana celler kan skilja spontant in vitro i celler av alla groddblad genom att gå igenom en flera härstamning samlade steg, i hESC-derived flera härstamning aggregat (embryoid organ), endast en mycket liten del av celler (&lt;2%) spontant differentieras till cardiomyocytes 13-15 (bild 1A). Efter immunoselection var berikad populationer av cardiomyocytes kunna fungera som biologiska pacemakers att rädda funktionen av en skadad hjärtmuskulaturen mekaniskt och elektroniskt efter injektion i hjärtat av djurmodeller 13. I gnagare infarktområdet modeller, var engrafted hESC-derived hjärt avkommor kunna överleva och mogna upp till 12 veckor, och delvis remuscularize den skadade hjärtat och förbättra kontraktila funktion 14,15. Har dock ineffektivitet att skapa mänskliga hjärt-engagerade celler genom flera släktled differentiering av pluripotenta celler och hög risk för tumorigenicitetsprov efter transplantation försvåras ytterligare kliniska översättning. Utveckla strategier för att kanalisera de breda differentiering potential pluripotenta hESCs exklusivt och förutsägbart att en hjärt fenotyp är viktigt att utnyttja kraften i hESC biologi i hjärtat området. För att uppnå enhetligt konvertering av mänskliga pluripotenta stamceller till en viss härstamning, anställde vi en definierad kultur system som kan försäkra spridning av odifferentierade hESCs att identifiera förutsättningar för välkontrollerade effektiv induktion av pluripotenta hESCs enbart till ett visst kliniskt relevant härstamning genom en enkel tillhandahållande av små molekyler (Fig. 1B). Vi fann att nikotinamid inducerade hjärt-härstamning engagemang direkt från pluripotent hESCs under definierade kultur som ytterligare utvecklats till att slå cardiomyocytes med hög verkningsgrad (bild 2). Nkx2.5 är en evolutionally bevaras homeobox transkriptionsfaktor nödvändig för normal hjärtfunktion utveckling och mutationer av genen är förknippade med mänskliga kongenital hjärtsjukdom (CHD), den vanligaste mänskliga missbildningar 16. Redovisning av Nkx2.5 är det tidigaste markören för celler hjärtat föregångare i alla ryggradsdjur hittills undersökts och är en förutsättning för korrekt hjärt septation och bildning / mognad av elektriska retledningssystem 16. I ryggradsdjur, uppkomsten och mönster tidiga Nkx2.5 uttryck sammanfaller ungefär med tidpunkten och området hjärt-specifikationen i början embryogenes och Nkx2.5 gen fortsätter att uttryckas genom utveckling i hjärtat 16. I vår hESC modell verkade NAM att utlösa hjärt induktion direkt från pluripotenta hESCs genom att främja ett uttryck för hjärt-specifika transcriav smörjmedel faktor Nkx2.5 i en process som kan efterlikna specifikationen av cardiomesoderm från pluripotenta epiblast i mänskliga embryonala cardiogenesis. Framtida studier kommer att avslöja genetiska och epigenetiska kontroll molekyler i människans hjärta utveckling som alternativ, vilket kan bana väg för liten molekyl-medierad direkt kontroll och modulering av hESC pluripotenta öde när härrör kliniskt relevanta linjer för regenerativ terapi. Utan NAM behandling kommer &lt;2% hESCs genomgår spontan differentiering till att slå cardiomyocytes 12-15. Med NAM behandling, har vi kunnat generera&gt; 95% embryonala hjärt prekursorer och&gt; 50% cardiomyocytes stryk av hESCs bibehålls som ett definiera kulturen i en process som kan efterlikna mänskliga embryonala hjärta utveckling 12. Nyligen har kända hjärt-ödet bestämma gener använts för att transdifferentiate musfibroblaster till postnatal slå cardiomyocytes med en låg verkningsgrad på &lt;0,5% 17, 18 &lt;/ Sup&gt;. Dock har omprogrammeras kroppsceller historiskt förknippats med onormalt genuttryck och accelererat åldrande med nedsatt terapeutiska nyttan 19-21. Slutligen är det protokoll som vi etablerat här begränsat till pluripotenta hESCs härrör från den inre cellmassan (ICM) eller epiblast av den mänskliga blastocysten 4,5, kan inte tillämpas på andra pluripotenta celler, inklusive djur har sitt ursprung ekonomiska och sociala råd, ekonomiska och sociala råden från tidigare Morula (åtta-cell)-stadiet embryon 22, och artificiellt omprogrammeras celler 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (tillval) </th></tr><tr><td> Gelatin </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356.231 </td><td> Tillväxtfaktor minskas </td></tr><tr><td> Mänskliga laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nikotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum ersättning </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM onödiga aminosyra-lösning (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminosyror lösning (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbinsyra </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Mänskliga transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Mänskliga bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Humant insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Mänskliga Activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Definierade FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-väl ultralåga fästplatta </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-brunnar </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Hittills har avsaknaden av en lämplig humana celler källa varit den största bakslag i återskapa den mänskliga hjärtmuskeln, antingen genom cellbaserade transplantation eller genom hjärtvävnad engineering 1-3. Cardiomyocytes bli obotligt differentierade strax efter födseln och förlorar sin förmåga att föröka sig. Det finns inga bevis för att stamceller / progenitorceller från andra källor, t.ex. benmärg eller navelsträngsblod, kan ge upphov till kontraktila hjärtmuskelceller efter transplantation in i hjärtat 1-3. Behovet av att förnya eller reparera den skadade hjärtmuskeln har inte uppfylls av adulta stamceller terapi, antingen endogena eller via cell leverans 1-3. De genetiskt stabila mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har obegränsad utbyggnad förmåga och obegränsad plasticitet och bjöd ut en pluripotenta reservoar för in vitro-härledning av stora leveranser av mänskliga somatiska celler som är begränsade till härstamning i behovav reparation och förnyelse 4,5. På grund av förekomsten av hjärt-och kärlsjukdomar i hela världen och akut brist på donerade organ är det intensivt intresse för att utveckla hESC-baserade behandlingar som ett alternativ. Men hur har att kanalisera det stora differentiering potential pluripotenta hESCs effektivt och förutsägbart till en önskad fenotyp varit en stor utmaning för både utvecklings-studier och kliniska översättning. Konventionella metoder är beroende av flera härstamning lutning pluripotenta celler genom spontana könsceller lager differentiering, vilket resulterar i ineffektiva och okontrollerbar härstamning-engagemang som ofta följs av fenotypisk heterogenitet och instabilitet därmed en hög risk för tumorigenicitetsprov 6-8 (se en schematisk i Fig.. 1A). Dessutom kan odefinierade utländska / djur biologiska kosttillskott och / eller matare som vanligen har använts för isolering, expansion och differentiering av hESCs direkt använder sådan cell-specialized transplantat hos patienter problematiskt 9-11. För att övervinna dessa hinder, vi har löst delar av en definierad kultur-systemet är nödvändig och tillräcklig för att upprätthålla den epiblast pluripotence av hESCs, fungerar som en plattform för de novo härledning av kliniskt lämplig hESCs och effektivt styra ett sådant hESCs jämnt mot kliniskt relevant härstamningar av små molekyler 12 (se en schematisk i bild. 1B). Efter screening olika små molekyler och tillväxtfaktorer, fann vi att sådana definierade villkor återges nikotinamid (NAM) tillräcklig för att förmå specifikation av cardiomesoderm direkt från pluripotenta hESCs att ytterligare utvecklats till cardioblasts som genereras mänskliga slå cardiomyocytes med hög verkningsgrad (bild 2 ). Vi fastställda villkor för induktion av cardioblasts direkt från pluripotenta hESCs utan en mellanliggande flera härstamning embryoid kroppen skede, vilket gör välkontrollerade effektiv härledning av ettstort utbud av humana celler inom hela spektrumet av utvecklingsstadier för cell-baserad terapi.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Vi har etablerat ett protokoll för induktion av cardioblasts direkt från pluripotenta mänskliga embryonala stamceller som upprätthålls enligt fastställda villkor med små molekyler, vilket möjliggör härledning av ett stort utbud av humana stamceller och funktionella cardiomyocytes för kardiovaskulära reparation.

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Kromatin Immunoprecipitation från mänskliga embryonala stamcellslinjer

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Kultur och underhåll av mänskliga embryonala stamcellslinjer

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Nedfrysning och upptining mänskliga embryonala stamcellslinjer

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolering och Härledning av Mouse Embryonala Germinal celler

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Beredning av mus Embryonala Fibroblastceller Lämplig för odling av humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Snabb och effektiv generering av nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller i en Multititre Plate format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...