Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van de National Science Foundation (subsidie ​​aantal MCB-0447750).

<ol>
	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De Ice-Cap-methode hier gepresenteerde laat een wetenschapper om weefselmonsters te verzamelen van honderden of zelfs duizenden, van individuele planten in een enkele dag en efficiënt genomische DNA-extract van deze monsters voor gebruik in de genotypering reacties. Door het geven van een individuele wetenschapper de mogelijkheid om duizenden zaailingen genotype in een korte periode van tijd, de Ice-Cap-methode heeft het potentieel om een ​​aantal genetische experimenten die anders niet zou praktisch zijn om uit te voeren te vergemakkelijken. Een aantal voorbeelden worden hieronder gegeven. <ol><li> Genetische Mapping. Fine-scale genetische mapping kan worden versneld als de onderzoeker in staat is om recombinatie gebeurtenissen te identificeren binnen een bepaald interval langs het chromosoom 3. Als dit interval gaat om een ​​zeer korte genetische afstand, dan is de recombinatie gebeurtenissen zullen relatief zeldzaam zijn in de segregerende mapping bevolking. Om deze reden kan het nodig zijn om het scherm van duizenden individuele planten op de gewenste re vindenCombinant individuen. Dit kan aanzienlijk worden versneld door het gebruik van Ice-Cap. Zelfs in het tijdperk van de genoom-brede re-sequencing, is het nog steeds noodzakelijk is om direct aan te tonen dat een bepaalde mutatie is direct verantwoordelijk voor een fenotype van belang. In deze gevallen zal het nodig zijn om de mutatie van de rente af te scheiden van andere nauw met elkaar verbonden mutaties in om aan te tonen een kandidaat-mutatie is eigenlijk oorzakelijke. In deze situaties, zouden Ice-Cap bieden een efficiënte methode voor het verbreken koppeling tussen een paar nauw verbonden mutaties. </li><li> Multi-mutanten. Het is gemeengoed geworden voor onderzoekers bestuderen van Arabidopsis aan mutant allelen van een aantal verschillende loci te combineren in een enkel individu om functionele redundantie 4-6 te overwinnen. Als voorbeeld, overweeg een zaak waar men wenst te mutante allelen combineren van vier verschillende loci in een enkele plant door middel van genetische kruising. Voor dit project, zal het nodig zijn om een ​​te genererenn individu dat heterozygoot is op deze vier loci, als onderdeel van de kruising regeling. Wanneer deze quadruple-sets heterozygote zaad, is de viervoudige homozygote verwacht aanwezig te zijn bij een snelheid van een van de 256 in de resulterende populatie van nageslacht. Screening voor deze zeldzame individu door traditionele methoden zou nogal arbeidsintensief. Ter vergelijking, zou de wetenschapper met behulp van Ice-Cap voor dit project te voorzien van een efficiënte strategie voor het identificeren van de zeldzame quadruple homozygote in een enkele generatie. </li><li> iTILLING. Ons laboratorium onlangs beschreef een nieuwe benadering voor screening op de aanwezigheid van de geïnduceerde mutaties in interessante genen in Arabidopsis 7. Deze methode is een variatie op een bestaande techniek genaamd Tilling die wordt gebruikt om mutaties vinden in geordende populaties van mensen die werden behandeld met een chemisch mutageen 8-10. We hebben onze methode iTILLING want het is een geïndividualiseerde versie van bewerken die het mogelijk maakt een individual wetenschapper iets dat traditioneel verplicht een groot onderzoeksteam in te vullen bereiken. Ice-Cap vormt een integraal onderdeel van de iTILLING methode 7, zoals hieronder beschreven. </li></ol> Het idee achter iTILLING is het produceren van een kortstondige mutant bevolking, die staat in tegenstelling tot de duurzame populaties mutant gemaakt voor de traditionele bewerken projecten. Voor iTILLING, worden zaden van een bulk M2 bevolking gezaaid in 50 tot 100 Ice Cap blokken, en DNA wordt geëxtraheerd met behulp van de Ice-Cap-methode. Arabidopsis zaailingen worden dan geplaatst bij 4 ° C, terwijl mutatie screening is uitgevoerd met behulp van de Ice-Cap-DNA preps. Tomaat zaailingen worden bewaard bij 12 ° C. Zodra zaailingen uitvoeren gewenste mutaties zijn geïdentificeerd, worden ze hersteld van de Ice-Cap platen en overgebracht naar de bodem. iTILLING is niet bedoeld als een langdurige mutant bevolking voor een hele onderzoeksgemeenschap te voorzien om het scherm. In plaats daarvan, iTILLING biedt een strategie waarmeeeen wetenschapper kan het scherm een ​​aangepaste mutant bevolking voor mutaties in een handvol genen snel, efficiënt en tegen een relatief lage kosten. Wij hebben gevonden Ice-Cap aan een effectieve methode voor het kweken van en genotypering Arabidopsis, tomaat en rijst. We verwachten dat andere soorten van planten ook moet worden ontvankelijk voor Ice-Cap. Een beperking van de verscheidenheid van soorten die kunnen worden opgevangen door Ice-Cap is de grootte van de zaden. Alleen planten met zaden klein genoeg om in de putjes van een 96-wells plaat zal compatibel zijn met Ice-Cap in de huidige configuratie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Machine voor het schudden Root platen voor DNA-extractie </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0384 </td><td> Handmatige warmte sealmachine gebruikt om Root Plates voorafgaand aan de weefsel verstoring </td></tr><tr><td> Centrifuge uitgerust met swingende microplaat carriers </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Elke centrifuge met swingende microplaat dragers geschikt zou zijn </td></tr><tr><td> MicroFill Microplate Dispenser </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Geautomatiseerde vloeistof dispenser voor het vullen van microplaten </td></tr><tr><td> BIALETTI merk17x11 inch Commerciële Grote Cookie Sheet </td><td> Target Warenhuis </td><td> www.bialetti.com </td><td> Deze specifieke bakplaat heeft de ideale diepte voor Ice-Cap </td></tr><tr><td> Custom Made Metal Rack </td><td> Hardware Store </td><td></td><td> Zie de tekst voor een volledige beschrijving </td></tr><tr><td> 33 Liter plastic opbergdoos </td><td> Target Warenhuis </td><td> Sterilite Brand </td><td> Voor de Ice-Cap Fountain. Plastic opbergdoos groot genoeg om de 17x11 inch bakpapier te houden </td></tr><tr><td> 30 liter per uur Fountain Pump </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Kleine dompelpomp fontein pomp verkrijgbaar bij de tuin aanbod winkels </td></tr><tr><td> Slang voor fontein pomp </td><td> Elke lab leveringsbedrijf </td><td></td><td> Slang compatibel met fontein pomp </td></tr><tr><td> Kunststof klem </td><td> Hardware Store </td><td></td><td> Klem om de slang vast te houden cookiesvel </td></tr><tr><td> Doorzichtige plastic deksels van Falcon Microtest vlakke bodem 96-well polystyreen platen </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Doorzichtige plastic deksels voor het afdekken van Ice-Cap Seedling Plates </td></tr><tr><td> 3M Micropore chirurgische tape </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch diameter roestvrij stalen ballen </td><td> Hartford Technologies, Rocky Hill, CT </td><td> 034 tot 006-1K </td><td> Gebruikt om de wortel weefsel kan verstoren na de oogst </td></tr><tr><td> 3 inch Elastische haarbanden </td><td> De plaatselijke supermarkt </td><td></td><td> Gebruikt om Root Plate vast te zetten Seedling Plate </td></tr><tr><td> 4 mm houten spiesjes </td><td> De plaatselijke supermarkt </td><td></td><td> Deze spiesjes worden gewoonlijk gebruikt om kabobs voor te bereiden </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc merk, een-mL filterplaten zonder frit </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> 96-wells Seedling platen met gaten in de bodem. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Well Tall-Schoorsteen PCR Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-well platen Root </td></tr><tr><td> Agar-agar - celkweek getest </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige en Skoog (MS) basale zoutmengsel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Easy Peel warmte afdichtingsfolie </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0745 </td><td> Warmte afdichting film voor het afdichten van Root Platen voorafgaand aan de weefsel verstoring </td></tr><tr><td> Duck Extra Wide Brand Packaging Tape, 3.00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Artikelnr. 21242139 </td><td> Plakbandvoor het afdichten van microplaten met DNA-extracten voor opslag </td></tr><tr><td> Afdichting Roller </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Hand held rollende hulpmiddel voor het persen van klevende afdichtingsband op microplaten </td></tr><tr><td> 96-well metalen thermische blok </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Gebruikt om de Root Platen voor tissue oogst bevriezen </td></tr><tr><td> Whatman filterpapier </td><td> Whatman International </td><td> 1002 090 </td><td> Gebruikt worden voor oppervlaktebehandeling steriliseren zaden </td></tr><tr><td> Wegwerp Pasteur pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 tot 678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;disposable Pasteur pipet wordt gebruikt voor het overbrengen van zaden om Seedling Plate </td></tr><tr><td> Pyrex ovenschaal (20 cm x 30 cm) </td><td> Target Warenhuis </td><td></td><td> Gebruikt om een ​​droogijs / ethanol bad te bouwen. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

Het wordt steeds vaker voor planten wetenschappers aan projecten die de genotypering van grote aantallen planten vereisen. De eerste stap in een genotypering project is om een ​​weefsel te verzamelen van elke individuele plant. De traditionele benadering van deze taak is om te proeven planten een-op-een-keer. Als men wil genotype honderden of duizenden mensen, maar het gebruik van deze strategie resulteert in een belangrijk knelpunt in de genotypering pijplijn. De Ice-Cap methode die we beschrijven hier biedt een high-throughput oplossing voor deze uitdaging doordat een wetenschapper om weefsel te verzamelen van enkele duizenden zaailingen in een enkele dag 1,2. Dit niveau van de doorvoer wordt mogelijk gemaakt door het feit dat weefsel wordt geoogst uit planten 96-bij-een-time, in plaats van een-op-een-keer. De Ice-Cap-methode biedt een geïntegreerd platform voor het uitvoeren van groei van zaailingen, weefsel oogst en DNA-extractie. De basis voor Ice-Cap is de groei van seedliNGS in een gestapelde paar van 96-wells platen. De putten van de bovenste plaat bevat stekkers van agar groei media waarop de individuele zaailingen ontkiemen. De wortels groeien naar beneden door de agar media, de bovenste plaat af te sluiten door middel van een gat, en gaan over in een onderplaat met water. Om de oogst weefsel voor DNA-extractie, het water in de onderste plaat met wortel weefsel snel bevroren, terwijl de zaailingen in de bovenste plaat blijven bij kamertemperatuur. De bovenste plaat wordt vervolgens uit de buurt van de onderste plaat geschild, waardoor een plaat met 96 wortel weefselmonsters bevroren in ijs en een plaat met 96 levensvatbaar zaailingen. De techniek is de naam &quot;Ice-Cap&quot;, omdat het gebruik maakt van ijs vast te leggen de wortel weefsel. De 96-well plaat met de zaailingen kunnen dan verpakt in folie en overgebracht naar lage temperatuur. Dit proces opschort verdere groei van de zaailingen, maar heeft geen invloed op hun levensvatbaarheid. Zodra genotype analyse is afgerond, kan zaailingen met de gewenste genotype worden overgedragen van de 96-wells plaat de bodem voor verdere vermeerdering. We hebben aangetoond dat het nut van de Ice-Cap methode met behulp van Arabidopsis thaliana, tomaat en rijst zaailingen. We verwachten dat de methode ook moeten gelden voor andere soorten van planten met zaden klein genoeg om in de putjes van 96-wells platen.

Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

De Ice-Cap-methode maakt het mogelijk om planten te kweken in 96-well platen en niet-destructieve oogst wortel weefsel van elke zaailing. DNA geëxtraheerd uit deze wortel weefsel kan worden gebruikt voor genotypering reacties. We hebben gevonden dat Ice-Cap goed werkt voor<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Tomaat en rijst zaailingen.

Ice-Cap: Een methode voor het kweken Arabidopsis En tomatenplanten in 96-well platen voor high-throughput genotypering

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Meten Ruimtelijke en temporele Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in Arabidopsis Planten

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Het meten van oxidatieve stress Weerstand van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-well microtiterplaten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Lichtwaaier fluorescentiemicroscopie van plantenwortels Kweken op het oppervlak van een gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...