Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (Grant-Nummer MCB-0447750) gefördert.

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	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Ice-Cap hier vorgestellte Methode ermöglicht ein Wissenschaftler an Gewebeproben von Hunderten oder sogar Tausenden von einzelnen Pflanzen an einem einzigen Tag zu sammeln und effizient zu extrahieren genomischer DNA aus den Proben für den Einsatz in Genotypisierung Reaktionen. Durch die Aufgabe von einzelnen Wissenschaftler die Möglichkeit, Tausende von Setzlingen in einem kurzen Zeitraum Genotyp hat der Ice-Cap-Methode das Potenzial, eine Reihe von genetischen Experimenten, die sonst nicht sinnvoll sein, führen Sie erleichtern würde. Einige Beispiele sind unten angegeben. <ol><li> Genetic Mapping. Fine-Skala genetische Kartierung kann beschleunigt werden, wenn der Forscher in der Lage ist, um eine Rekombination Ereignisse innerhalb eines bestimmten Intervalls entlang der Chromosom 3 identifiziert werden. Wenn dieses Intervall mit einem sehr kurzen genetischen Distanz, dann die Rekombination Veranstaltungen werden relativ selten in der Trennung Mapping Bevölkerung. Aus diesem Grund kann es notwendig sein, um Bildschirm Tausende von einzelnen Pflanzen, um die gewünschte wieder findenrekombinante Individuen. Dieser Prozess könnte wesentlich durch den Einsatz von Ice-Cap beschleunigt werden. Auch im Zeitalter der Genom-weite Re-Sequenzierung, ist es noch notwendig, um direkt zu demonstrieren, dass eine bestimmte Mutation direkt verantwortlich für einen Phänotyp von Interesse ist. In diesen Fällen wird es notwendig sein, die interessierende Mutation weg zu trennen von anderen eng miteinander verknüpft Mutationen um zu beweisen, ein Kandidat Mutation tatsächlich ursächlich. In diesen Situationen würde Ice-Cap bieten eine effiziente Methode für das Brechen Verknüpfung zwischen einem Paar eng miteinander verbunden Mutationen. </li><li> Multi-Mutanten. Es hat sich für die Forscher studieren Arabidopsis, um mutierte Allele von mehreren verschiedenen Loci in einer einzigen Person zu kombinieren, um funktionelle Redundanz 4-6 überwinden gemeinsam. Als Beispiel betrachten wir einen Fall, wo man wünscht, Mutanten-Allele aus vier verschiedenen Loci kombinieren in einer einzigen Pflanze durch genetische Kreuzung. Für dieses Projekt wird es notwendig sein, einen zu generierenn Person, heterozygot ist an diesen vier loci als Teil der Kreuzung Schema. Wenn diese Vierfach-heterozygote Sets Saatgut ist die vierfache homozygote voraussichtlich mit einer Rate von einem von 256 in der daraus resultierenden Population von Nachkommen präsentieren. Screening für diesen seltenen Einzelfällen mit herkömmlichen Methoden wäre ziemlich arbeitsintensiv. Im Vergleich dazu würde mit Ice-Cap für dieses Projekt der Wissenschaftler mit einer effizienten Strategie zur Identifizierung der seltenen Vierfach-Homozygoten in einer einzigen Generation bieten. </li><li> iTILLING. Unser Labor kürzlich über einen neuen Ansatz zur Screening auf das Vorhandensein von induzierten Mutationen in Genen von Interesse in Arabidopsis 7. Diese Methode ist eine Variante einer etablierten Technik namens TILLING, dass wird verwendet, um Mutationen in geordneten Populationen von Individuen mit einem chemischen Mutagen 8-10 behandelt zu finden. Wir haben unsere Methode iTILLING genannt, weil es eine individualisierte Version des TILLING, dass ein ind erlaubt istividual Wissenschaftler zu erreichen etwas, das traditionell ein großes Forscherteam um komplette verlangt hat. Ice-Cap ist ein integraler Bestandteil der iTILLING Methode 7, wie unten beschrieben. </li></ol> Die Idee hinter iTILLING ist eine ephemere mutierten Bevölkerung, die im Gegensatz zu den langlebigen Mutanten Bevölkerung für traditionelle TILLING Projekte erstellt steht zu produzieren. Für iTILLING werden die Samen aus einer bulked M2 Bevölkerung in 50 bis 100 Ice Cap Blöcken gesät, und die DNA extrahiert wird mit dem Ice-Cap-Verfahren. Arabidopsis-Keimlinge sind dann bei 4 ° C, während Mutations-Screening erfolgt mit dem Ice-Cap DNA preps. Tomatenjungpflanzen sind bei 12 ° C gelagert. Wenn Sämlinge tragen gewünschten Mutationen identifiziert worden sind, werden sie aus dem Ice-Cap Platten wiederhergestellt und an Boden. iTILLING ist nicht beabsichtigt, eine langfristige mutierten Bevölkerung für eine gesamte Forschung auf dem Bildschirm sorgen. Stattdessen bietet iTILLING eine Strategie, durch dieein Wissenschaftler kann eine benutzerdefinierte mutierten Bevölkerung auf Mutationen in einer Handvoll von Genen schnell Bildschirm, effizient und auf einem relativ niedrigen Kosten. Wir haben Ice-Cap gefunden, um eine effektive Methode für den Anbau und die Genotypisierung Arabidopsis, Tomaten und Reis. Wir erwarten, dass andere Arten von Pflanzen sollte auch zugänglich sein Ice-Cap. Eine Einschränkung auf die Vielfalt der Arten, die von Ice-Cap untergebracht werden kann, ist die Größe der Samen. Nur Pflanzen mit Samen klein genug, um in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte fit ist kompatibel mit Ice-Cap in seiner jetzigen Konfiguration.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Maschinen zum Schütteln Root-Platten für die DNA-Extraktion </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0384 </td><td> Manuelle Heißsiegelmaschine verwendet werden, um Root-Platten vor Gewebeaufschluss </td></tr><tr><td> Zentrifuge ausgestattet mit schwingenden Mikrotiterplattenträger </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Jede Zentrifuge mit schwingenden Microplatte Träger geeignet wären </td></tr><tr><td> MICROFILL Microplate Dispenser </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Automatisierte Flüssigkeitsspender zum Befüllen Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> Bialetti Marke17x11 Zoll Handelsregister großen Backblech </td><td> Ziel Kaufhaus </td><td> www.bialetti.com </td><td> Diese spezifische Backblech hat die ideale Tiefe für Ice-Cap </td></tr><tr><td> Custom Made Metallgestell </td><td> Eisenwarengeschäft </td><td></td><td> Siehe Text für vollständige Beschreibung </td></tr><tr><td> 33 Liter Kunststoff-Aufbewahrungsbox </td><td> Ziel Kaufhaus </td><td> Sterilite Marke </td><td> Für Ice-Cap-Brunnen. Kunststoff-Aufbewahrungsbox groß genug, um die 17x11 Zoll Backblech halten </td></tr><tr><td> 30 Gallonen pro Stunde Wasserspielpumpen </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Kleine Tauchpumpe Brunnen Pumpe unter Garten-Versorgung-Läden </td></tr><tr><td> Schlauch für Brunnen-Pumpe </td><td> Jedes Labor EVU </td><td></td><td> Hose mit Brunnen Pumpe </td></tr><tr><td> Plastic Clamp </td><td> Eisenwarengeschäft </td><td></td><td> Clamp-Schlauch zu halten CookieBlatt </td></tr><tr><td> Klare Kunststoffdeckel von Falcon Microtest flachem Boden 96-well Platten aus Polystyrol </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Klare Kunststoff Abdeckungen für Ice-Cap Sämling Plates </td></tr><tr><td> 3M Micropore chirurgischen Band </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch Durchmesser Edelstahlkugeln </td><td> Hartford Technologies, Rocky Hill, CT </td><td> 034 bis 006-1K </td><td> Wird verwendet, um Wurzelgewebe nach der Ernte zerstören </td></tr><tr><td> 3-Zoll-Elastic Haarbänder </td><td> Lokale Lebensmittelgeschäft </td><td></td><td> Wird verwendet, um Root-Platte zu Platte zu sichern Sämling </td></tr><tr><td> 4 mm Durchmesser Holzspieße </td><td> Lokale Lebensmittelgeschäft </td><td></td><td> Diese Spieße werden in der Regel verwendet, um kabobs vorbereiten </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc Marke 1-mL Filterplatten ohne Fritte </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> 96-well Platten Sämling mit Löchern im Boden. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-well Platten Wurzel </td></tr><tr><td> Agar - Zellkultur getestet </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinethansulfonsäure (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige und Skoog (MS) basalen Salzmischung </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Easy Peel Wärme Dichtfolie </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0745 </td><td> Heißsiegelfolie zur Abdichtung Root-Platten vor Gewebeaufschluss </td></tr><tr><td> Ente Marke Extra Wide Tape, 3,00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Artikel-Nr. 21242139 </td><td> Klebebandzum Abdichten von Mikroplatten mit DNA-Extrakten für die Lagerung </td></tr><tr><td> Siegelwalze </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Hand gehalten Rollwerkzeug zum Pressen Dichtband auf Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> 96-Loch-Metall Thermoblock </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Wird verwendet, um die Root-Platten für die Gewebe-Ernte eingefroren </td></tr><tr><td> Whatman Filterpapier </td><td> Whatman International </td><td> 1002 090 </td><td> Wird für die Oberfläche Sterilisation Samen </td></tr><tr><td> Einweg-Pasteur Pipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;Einweg-Pasteur-Pipette für die Übertragung von Samen Sämling Platte verwendet </td></tr><tr><td> Pyrex Backform (20 cm x 30 cm) </td><td> Ziel Kaufhaus </td><td></td><td> Wird verwendet, um einem Trockeneis / Ethanol-Bad zu bauen. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

Es wird immer für den Anlagenbau Wissenschaftler gemeinsam Projekte, die die Genotypisierung einer großen Zahl von Anlagen erfordern entwickeln. Der erste Schritt in eine Genotypisierung Projektes ist es, eine Gewebeprobe aus einzelnen Pflanzen zu sammeln. Der traditionelle Ansatz, um diese Aufgabe ist es, Probe Pflanzen one-at-a-time. Will man Genotyp Hunderte oder Tausende von Einzelpersonen, aber mit dieser Strategie führt zu einer deutlichen Engpass bei der Genotypisierung Pipeline. Die Ice-Cap-Methode, die wir hier beschreiben, ist ein High-Throughput-Lösung für diese Herausforderung, indem ein Wissenschaftler, um Gewebe aus mehreren tausend Sämlinge an einem einzigen Tag 1,2 sammeln. Dieses Maß an Durchsatz wird durch die Tatsache, dass Gewebe aus Pflanzen ist 96-at-a-time geerntet, sondern als ein-at-a-time. Die Ice-Cap-Verfahren stellt eine integrierte Plattform für die Durchführung Sämlingwachstum-, Gewebe-Ernte, und die DNA-Extraktion. Die Grundlage für die Ice-Cap ist das Wachstum der seedlings in einem gestapelten Paar von 96-Well-Platten. Die Brunnen der oberen Platte enthalten Stecker von Agar Nährmedien, auf denen einzelne Sämlinge keimen. Die Wurzeln wachsen nach unten durch den Agar-Medien, beenden Sie das obere Platte durch ein Loch, und gelangen in eine untere Platte mit Wasser. Zur Ernte Gewebe zur DNA-Extraktion, das Wasser in der unteren Platte, die Wurzel Gewebe schnell eingefroren, solange die Keimlinge in der oberen Platte bei Raumtemperatur bleiben. Die obere Platte wird dann von der unteren Platte, geschält Nachgeben einer Platte mit 96 root Gewebeproben in Eis und eine Platte mit 96 lebensfähige Sämlinge eingefroren. Die Technik trägt den Namen &quot;Ice-Cap&quot;, weil es Eis verwendet, um die Wurzel Gewebe zu erfassen. Der 96-Well-Platte mit den Setzlingen kann dann in Folie verpackt und auf niedriger Temperatur. Dieser Prozess setzt ein weiteres Wachstum der Sämlinge, aber keinen Einfluss auf ihre Lebensfähigkeit. Nach Analyse des Genotyps abgeschlossen ist, können Sämlinge mit den gewünschten Genotyp aus dem 96-Loch-p übertragen werdenspät, um Boden für die weitere Vermehrung. Wir haben den Nutzen des Ice-Cap-Verfahren mit Arabidopsis thaliana, Tomaten und Reis Sämlinge unter Beweis gestellt. Wir erwarten, dass die Methode sollte auch für andere Arten von Pflanzen mit Samen klein genug, um in die Vertiefungen von 96-Well-Platten passen.

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Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Die Ice-Cap-Verfahren erlaubt es, Pflanzen in 96-Well-Platten und zerstörungsfrei Ernte Wurzelgewebe von jedem Sämling wachsen. DNA von dieser Wurzel Gewebe extrahiert werden können für die Genotypisierung Reaktionen eingesetzt werden. Wir haben festgestellt, dass Ice-Cap gut für<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Tomaten und Reis Sämlinge.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

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