Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (מענק מספר MCB-0447750).

<ol>
	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטת הקרח יתר המוצגים כאן מאפשרת מדען כדי לאסוף דגימות רקמה מתוך מאות או אפילו אלפים, של צמחים בודדים ביום אחד וביעילות לחלץ הדנ&quot;א הגנומי ממדגמים אלה לשימוש התגובות genotyping. על ידי מתן מדען הפרט את היכולת גנוטיפ אלפי שתילים בתקופה קצרה של זמן, את שיטת הקרח יתר יש פוטנציאל להקל על מספר ניסויים גנטיים שאחרת לא להיות מעשיים לביצוע. דוגמאות אחדות מוצגים להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיפוי גנטי. פיין בקנה מידה מיפוי גנטי יכול להיות מהיר אם החוקר הוא מסוגל לזהות אירועי רקומבינציה בתוך מרווח מסוים לאורך כרומוזום 3. אם מרווח זה כרוך מרחק גנטי קצר מאוד, אז האירועים רקומבינציה תהיה נדירה יחסית באוכלוסייה מיפוי segregating. מסיבה זו, ייתכן שיהיה צורך לאלפי מסך של צמחים בודדים כדי למצוא מחדש את הרצויאנשים combinant. תהליך זה יכול להיות מהיר מאוד על ידי שימוש יתר קרח. גם בעידן של סידור מחדש הגנום כולו, הוא עדיין צריך להוכיח ישירות מוטציה נתון הוא אחראי ישירות הפנוטיפ של עניין. במקרים אלה, יהיה צורך להפריד את המוטציה עניין הרחק מוטציות קשר הדוק אחרים כדי להוכיח מוטציה מועמד היא בעצם סיבתי. במצבים כאלה, קרח יתר יספק שיטה יעילה לשבירת הקשר בין זוג של מוטציות קשור קשר הדוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Multi-מוטנטים. זה הפך להיות משותף לחוקרים ללמוד ארבידופסיס לשלב אללים מוטנטים שונים של לוקוסים מספר לתוך אדם אחד כדי להתגבר על יתירות תפקודית 4-6. כדוגמה, לשקול מקרה שבו אדם רוצה לשלב אללים מוטנטים מארבע לוקוסים שונים לתוך הצמח יחיד דרך מעבר גנטית. עבור פרויקט זה, יהיה צורך ליצורn אדם אשר הטרוזיגוטיים על ארבעת לוקוסים כחלק מתוכנית המעבר. כאשר הזרע הזה מרובעת-heterozygote קובע, הומוזיגוטי מרובעת צפוי להיות נוכח בשיעור של אחד מתוך 256 באוכלוסייה כתוצאה של הצאצאים. הקרנת לאדם זה נדיר על ידי שיטות מסורתיות יהיה מאוד עבודה אינטנסיבית. לשם השוואה, באמצעות קרח יתר עבור פרויקט זה יספק את המדען עם אסטרטגיה יעילה לזיהוי הומוזיגוטי מרובעת נדיר בדור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iTILLING. במעבדה שלנו לאחרונה תיאר גישה חדשנית סינון עבור נוכחות של מוטציות בגנים המושרה עניין 7 ארבידופסיס. שיטה זו היא וריאציה על טכניקה ממוסדת בשם חורש המשמש למצוא מוטציות הורה אוכלוסיות של אנשים שטופלו mutagen כימיים 8-10. יש לנו שם השיטה שלנו iTILLING כי הוא גרסה אישית של חורש המאפשר indמדען ividual להשיג משהו שיש לו חובה מסורתי צוות מחקר גדול להשלים. Ice יתר מהווה חלק בלתי נפרד של השיטה iTILLING 7, כמתואר להלן. </li></ol> הרעיון מאחורי iTILLING היא לייצר האוכלוסייה מוטציה חלוף, אשר עומד בניגוד לאוכלוסיות מוטנטים עמידים נוצר לפרויקטים לעבד המסורתית. עבור iTILLING, זרעים מתוך אוכלוסייה M2 התנשא נזרעים לתוך 50-100 בלוקים שווי קרח, ו-DNA מופק בשיטת קרח יתר. שתילים ארבידופסיס ממוקמות אז 4 ° C תוך הקרנת מוטציה מתבצעת באמצעות ה-DNA קרח יתר preps. שתילי עגבניות מאוחסנים על 12 ° C.. לאחר שתילים מוטציות הרצוי נושאת זוהו, הם התאוששו הקרח יתר צלחות הועבר אדמה. iTILLING אינו מיועד לספק לאוכלוסייה לטווח ארוך מוטציה למען הקהילה המחקר כולו למסך. במקום זאת, iTILLING מספק האסטרטגיה שבאמצעותהמדען אחד יכול מסך האוכלוסייה מוטציה מותאמות אישית עבור מוטציות קומץ של גנים במהירות, ביעילות, ובמחיר נמוך יחסית. מצאנו קרח יתר להיות שיטה יעילה לגידול genotyping, ארבידופסיס עגבניות ואורז. אנו צופים כי מינים אחרים של צמחים צריכים גם להיות מקובל יתר קרח. מגבלה אחת על מגוון המינים שניתן לאכלס על ידי Ice-Cap הוא בגודל של הזרעים. רק צמחים עם הזרעים קטן מספיק כדי להתאים לתוך הבארות של צלחת 96-טוב יהיה תואם יתר קרח בתצורה הנוכחית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / מלתעה </td><td> מכונת עבור רועד פלטות רוט להפקת DNA </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-אוטם </td><td> ABgene ארה&quot;ב </td><td> AB-0384 </td><td> איטום ידני חום המכונה משמש פלטות שורש לפני שיבוש רקמה </td></tr><tr><td> צנטריפוגה מצויד נושאות microplate מתנדנד </td><td> Beckman Coulter </td><td> אלגרה 25R </td><td> כל צנטריפוגה עם ספקים microplate מתנדנד יהיה מתאים </td></tr><tr><td> MicroFill Dispenser microplate </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> מנפק נוזל מילוי אוטומטי עבור microplates </td></tr><tr><td> מותג Bialettiקוקי 17x11 ס&quot;מ מסחרי גדול גיליון </td><td> יעד Department Store </td><td> www.bialetti.com </td><td> זה נייר אפייה ספציפי יש עומק אידיאלי עבור יתר הקרח </td></tr><tr><td> Custom Made ארון מתכת </td><td> חומרה Store </td><td></td><td> ראו טקסט תיאור מלא </td></tr><tr><td> 33 ליטר פלסטיק תיבת אחסון </td><td> יעד Department Store </td><td> Sterilite מותג </td><td> עבור מזרקת קרח יתר. אחסון קופסת פלסטיק גדול מספיק כדי להכיל את גיליון 17x11 ס&quot;מ עוגיה </td></tr><tr><td> 30 ליטר לכל משאבת מזרקה שעה </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> משאבת מזרקה קטנה הצוללת זמין בחנויות אספקת גן </td></tr><tr><td> צינור עבור משאבת מזרקה </td><td> כל ההיצע מעבדה החברה </td><td></td><td> תואם משאבת מזרקה צינור </td></tr><tr><td> פלסטיק קלאמפ </td><td> חומרה Store </td><td></td><td> קלאמפ להחזיק צינור עוגיהסדין </td></tr><tr><td> מכסי פלסטיק שקוף מלמטה Microtest פלקון שטוח 96-היטב צלחות קלקר </td><td> BD פלקון www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> מכסי פלסטיק שקוף לכיסוי הקרח יתר פלטות שתיל </td></tr><tr><td> 3M micropore באיספלנית </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch נירוסטה בקוטר של כדורי פלדה </td><td> הרטפורד טכנולוגיות, רוקי היל, CT </td><td> 034-006-1K </td><td> משמש כדי לשבש את רקמת השורש לאחר הקטיף </td></tr><tr><td> 3 אינץ שיער גומיות </td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td></td><td> משמש כדי להבטיח פלייט שורש כדי פלייט שתיל </td></tr><tr><td> 4 מ&quot;מ קוטר שיפודי עץ </td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td></td><td> שיפודי אלה משמשים בדרך כלל להכין קבבוני </td></tr><tr><td> פישר סיינטיפיק Nunc המותג, 1-mL צלחות מסנן ללא frit </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 278012 </td><td> 96, גם שתיל פלטות עם חורים בתחתית. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-ובכן גבוה-PCR ארובה פלייט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-230-242 </td><td> גם 96-Root פלטות </td></tr><tr><td> אגר - תרבית תאים נבדק </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic חומצה (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige ו Skoog (MS) תערובת מלח הבסיס </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> פיל חום קל איטום לסכל </td><td> ABgene ארה&quot;ב </td><td> AB-0745 </td><td> איטום מחממים סרט לאיטום פלטות שורש לפני שיבוש רקמה </td></tr><tr><td> מותג דאק אריזות אקסטרה רחב סרט, 3.00 &quot;x 54.6 yd </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> פריט לא. 21242139 </td><td> סרט דבקעבור microplates איטום המכיל תמציות DNA לאחסון </td></tr><tr><td> איטום רולר </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> יד החזיקה כלי מתגלגל לכבישה סרט דבק איטום על microplates </td></tr><tr><td> 96-היטב מתכת תרמית לחסום </td><td> קולמן בן הזוג </td><td> 36400-66 </td><td> משמש להקפיא את צלחות רוט לקציר רקמה </td></tr><tr><td> Whatman נייר סינון </td><td> Whatman הבינלאומי </td><td> 1002 090 </td><td> משמש לחיטוי זרעים פני השטח </td></tr><tr><td> פנויה פיפטה פסטר </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;פיפטה פסטר חד פעמי המשמש להעברת זרעים פלייט שתיל </td></tr><tr><td> פיירקס תבנית אפייה (20 ס&quot;מ X 30 ס&quot;מ) </td><td> יעד Department Store </td><td></td><td> משמש לבנות אמבט קרח יבש / אתנול. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

זה הופך נפוץ עבור מדענים צמח לפתח פרויקטים הדורשים את genotyping של מספר גדול של צמחים. השלב הראשון בכל פרויקט genotyping היא לאסוף דגימת רקמה מצמח בנפרד. הגישה המסורתית משימה זו לצמחים מדגם אחד ב-פסק זמן. אם אדם רוצה גנוטיפ מאות או אלפי אנשים, לעומת זאת, באמצעות תוצאות האסטרטגיה צוואר בקבוק משמעותי בצנרת genotyping. שיטת הקרח יתר שאנו מתארים כאן מספק פתרון תפוקה גבוהה לאתגר זה בכך שהוא מאפשר מדען אחד לאסוף רקמה כמה אלפי שתילים ב 1,2 יום אחד. רמה זו של התפוקה מתאפשר על ידי העובדה כי רקמות שנקטפו מצמחים 96-at-פסק זמן, ולא אחת בכל פעם-a-. שיטת הקרח יתר מספק פלטפורמה משולבת לביצוע צמיחה שתיל, קציר רקמות, מיצוי DNA. הבסיס יתר הקרח הצמיחה של seedliNGS בזוג מגובב של 96-גם הצלחות. הבארות של צלחת העליון מכילים תקעים של צמיחה התקשורת אגר בו שתילים בודדים לנבוט. השורשים לצמוח למטה דרך התקשורת אגר, צא צלחת העליון דרך חור, ומעבירים למים צלחת נמוך המכיל. כדי לקצור רקמה להפקת DNA, המים צלחת התחתון המכיל רקמות השורש הוא קפוא במהירות בעוד שתילי בצלחת העליונה להישאר בטמפרטורת החדר. צלחת העליון הוא קלופים אז מן הצלחת התחתון, מניב צלחת אחת עם 96 דגימות רקמה שורש קפואים בקרח אחד צלחת עם 96 שתילים קיימא. הטכניקה נקראת &quot;קרח יתר&quot;, כי היא משתמשת קרח כדי ללכוד את רקמות השורש. צלחת 96-המכילה גם את השתילים אז יכול עטוף בנייר כסף והועבר בטמפרטורה נמוכה. תהליך זה משהה צמיחה נוספת של שתילים, אך אינו משפיע על יכולת הקיום שלהם. לאחר ניתוח גנוטיפ הושלמה, שתילים עם גנוטיפ הרצוי ניתן להעביר גם 96-pמאוחר לקרקע עבור התפשטות נוספת. אנחנו הדגימו את התועלת של השיטה קרח יתר באמצעות thaliana ארבידופסיס עגבניות, אורז ושתילים. אנו צופים כי השיטה צריכה גם לחול על מינים אחרים של צמחים עם הזרעים קטן מספיק כדי להתאים לתוך הבארות של 96-גם הצלחות.

Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

שיטת הקרח יתר מאפשר לגדל צמחים צלחות 96-היטב שאינם destructively שורש רקמה מן הקציר שתיל אחד. הדנ&quot;א מופק רקמות השורש הזה יכול לשמש התגובות genotyping. מצאנו כי קרח יתר עובד היטב עבור<em&gt; ארבידופסיס thaliana</em&gt;, עגבניות, שתילי האורז.

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג&#39;ל

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...