Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या MCB-+०४४७७५०) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

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	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

आइस कैप यहाँ प्रस्तुत पद्धति एक वैज्ञानिक के लिए सैकड़ों या भी हजारों एक ही दिन में अलग - अलग पौधों की से ऊतकों के नमूनों को इकट्ठा करने और कुशलता से उन नमूनों से जीनोटाइपिंग प्रतिक्रियाओं में उपयोग के लिए जीनोमिक डीएनए निकालने में सक्षम बनाता है. एक व्यक्ति वैज्ञानिक seedlings के हजारों करने के लिए समय की एक छोटी अवधि में जीनोटाइप की क्षमता देकर, आइस कैप विधि आनुवंशिक प्रयोगों है कि अन्यथा प्रदर्शन करने के लिए व्यावहारिक नहीं होगा की एक संख्या की सुविधा की क्षमता है. कई उदाहरण नीचे प्रदान की जाती हैं. <ol><li> जेनेटिक मानचित्रण. ठीक पैमाने पर आनुवंशिक मानचित्रण अगर शोधकर्ता 3 गुणसूत्र के साथ एक विशिष्ट अंतराल के भीतर पुनर्संयोजन घटनाओं की पहचान करने में सक्षम है तेजी किया जा सकता है. यदि इस अंतराल एक बहुत ही कम आनुवंशिक दूरी शामिल है, तो पुनर्संयोजन घटनाओं अपेक्षाकृत दुर्लभ segregating मानचित्रण जनसंख्या में हो जाएगा. इस कारण से, यह अलग - अलग पौधों के हजारों स्क्रीन करने के लिए आवश्यक हो वांछित फिर से मिल सकता हैcombinant व्यक्तियों. आइस कैप के उपयोग के माध्यम से यह प्रक्रिया बहुत तेजी किया जा सकता है. जीनोम चौड़ा पुनः अनुक्रमण के युग में भी, यह अभी भी आवश्यक है करने के लिए सीधे दिखाना है कि किसी दिए गए उत्परिवर्तन ब्याज की एक phenotype के लिए सीधे तौर पर जिम्मेदार है. इन मामलों में, यह ब्याज के उत्परिवर्तन बारीकी से जुड़े अन्य म्यूटेशनों से दूर अलग क्रम में साबित करने के लिए के लिए एक उम्मीदवार उत्परिवर्तन वास्तव में प्रेरणा के लिए आवश्यक हो जाएगा. इन स्थितियों में, आइस कैप कसकर जुड़ा हुआ म्यूटेशनों की एक जोड़ी के बीच संबंध तोड़ने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करेगा. </li><li> मल्टी - म्यूटेंट. यह Arabidopsis अध्ययन शोधकर्ताओं ने एक व्यक्ति में कई अलग loci से उत्परिवर्ती alleles गठबंधन करने के लिए कार्यात्मक 4-6 अतिरेक पर काबू पाने के लिए आम बन गया है. एक उदाहरण के रूप में, एक मामले में जहां एक चार अलग अलग loci से आनुवंशिक पार के माध्यम से एक एकल संयंत्र में उत्परिवर्ती alleles गठबंधन की इच्छा पर विचार करें. इस परियोजना के लिए, यह एक उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो जाएगाn व्यक्ति है कि पार योजना के भाग के रूप में इन चार loci में विषमयुग्मजी है. जब इस चौगुनी विषम युग्मज सेट बीज, चौगुनी homozygote एक की एक संतान के परिणामस्वरूप जनसंख्या में 256 की दर पर उपस्थित होने की उम्मीद है. परंपरागत तरीके से इस दुर्लभ व्यक्ति के लिए स्क्रीनिंग काफी श्रम गहन होगा. तुलना करके, इस परियोजना के लिए आइस कैप का उपयोग एक ही पीढ़ी में दुर्लभ चौगुनी homozygote की पहचान करने के लिए एक कुशल रणनीति के साथ वैज्ञानिक प्रदान करेगा. </li><li> iTILLING. हमारी प्रयोगशाला हाल ही में 7 Arabidopsis में ब्याज की जीन में प्रेरित म्यूटेशनों की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन किया. इस विधि बुलाया tilling है कि व्यक्तियों के साथ एक रासायनिक 8-10 उत्परिवर्तजन इलाज का आदेश दिया आबादी में परिवर्तन को खोजने के लिए प्रयोग किया जाता है एक की स्थापना की तकनीक पर एक भिन्नता है. हम हमारे iTILLING विधि का नाम है क्योंकि यह tilling की एक individualized संस्करण है कि एक इंडस्ट्रीज़ की अनुमति देता है हैividual वैज्ञानिक को पूरा करने के लिए कुछ है कि परंपरागत एक बड़े शोध टीम को पूरा करने की आवश्यकता है. आइस कैप iTILLING 7 विधि का एक अभिन्न हिस्सा है, के रूप में नीचे वर्णित है . </li></ol> iTILLING के पीछे विचार यह एक अल्पकालिक उत्परिवर्ती जनसंख्या है, जो टिकाऊ उत्परिवर्ती पारंपरिक tilling परियोजनाओं के लिए बनाई गई आबादी के विपरीत में खड़ा है उपज है. ITILLING के लिए, 50 से 100 आइस कैप ब्लॉक में एक bulked M2 आबादी से बीज बोया जाता है, और डीएनए आइस कैप विधि का उपयोग करने के लिए निकाला जाता है Arabidopsis seedlings तो 4 में रखा जाता है. डिग्री सेल्सियस जबकि उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग डीएनए आइस कैप का उपयोग किया जाता है preps. टमाटर seedlings 12 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे हैं. एक बार seedlings को ले जाने के लिए वांछित म्यूटेशन की पहचान की गई है, वे आइस कैप प्लेटों से बरामद कर रहे हैं और मिट्टी को हस्तांतरित. iTILLING स्क्रीन करने के लिए एक पूरे समुदाय अनुसंधान के लिए एक लंबे समय से स्थायी उत्परिवर्ती जनसंख्या प्रदान करने के लिए इरादा नहीं है. इसके बजाय, iTILLING एक रणनीति प्रदान करता है जिसके द्वाराएक वैज्ञानिक जीन की एक मुट्ठी में परिवर्तन के लिए एक कस्टम उत्परिवर्ती जनसंख्या जल्दी स्क्रीन, कुशलतापूर्वक, और एक अपेक्षाकृत कम लागत पर कर सकते हैं. हम आइस कैप के लिए बढ़ रही है और जीनोटाइपिंग Arabidopsis, टमाटर, चावल, और के लिए एक प्रभावी तरीका हो पाया है. हमें उम्मीद है कि पौधों की अन्य प्रजातियां भी आइस कैप के लिए उत्तरदायी होना चाहिए. प्रजातियों की विविधता है कि आइस कैप द्वारा समायोजित किया जा सकता है पर एक सीमा के बीज के आकार है. काफी छोटे बीज के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में फिट के साथ ही पौधों को इसके वर्तमान विन्यास में आइस कैप के साथ संगत हो जाएगा.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, न्यू जर्सी </td><td> 2000 Geno / चक्की </td><td> डीएनए निष्कर्षण के लिए रूट प्लेट्स हिलाते हुए करने के लिए मशीन </td></tr><tr><td> थर्मो - मुहर ABgene </td><td> ABgene संयुक्त राज्य अमेरिका </td><td> अटल बिहारी 0384 </td><td> मैन्युअल गर्मी सील रूट प्लेट्स के लिए इस्तेमाल किया ऊतकों के विघटन से पहले मशीन </td></tr><tr><td> झूलते microplate वाहक के साथ सुसज्जित अपकेंद्रित्र </td><td> Beckman कल्टर </td><td> Allegra 25R </td><td> झूलते microplate वाहक के साथ कोई अपकेंद्रित्र उपयुक्त होगा </td></tr><tr><td> MicroFill Microplate औषधि </td><td> Biotek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Microplates भरने के लिए स्वचालित तरल निकालने की मशीन </td></tr><tr><td> Bialetti ब्रांड17x11 इंच वाणिज्यिक बड़े कुकी शीट </td><td> लक्ष्य विभाग के स्टोर </td><td> www.bialetti.com </td><td> यह विशिष्ट कुकी शीट आइस कैप के लिए आदर्श गहराई </td></tr><tr><td> कस्टम मेड धातु रैक </td><td> हार्डवेयर की दुकान </td><td></td><td> पूर्ण विवरण के लिए पाठ देखें </td></tr><tr><td> 33 लीटर प्लास्टिक भंडारण बॉक्स </td><td> लक्ष्य विभाग के स्टोर </td><td> Sterilite ब्रांड </td><td> आइस कैप फाउंटेन के लिए. प्लास्टिक भंडारण काफी बड़े के लिए 17x11 इंच कुकी शीट पकड़ बॉक्स </td></tr><tr><td> घंटे Fountain पम्प 30 प्रति गैलन </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> लघु पनडुब्बी फव्वारा बगीचे की आपूर्ति दुकानों पर उपलब्ध पंप </td></tr><tr><td> फव्वारा पंप के लिए नली </td><td> कोई प्रयोगशाला की आपूर्ति कंपनी </td><td></td><td> फव्वारा पंप के साथ संगत नली </td></tr><tr><td> प्लास्टिक क्लैंप </td><td> हार्डवेयर की दुकान </td><td></td><td> कुकी नली पकड़ क्लैंपचादर </td></tr><tr><td> फाल्कन MICROTEST फ्लैट 96 अच्छी तरह से नीचे polystyrene प्लेटों से साफ प्लास्टिक lids </td><td> बी.डी. फाल्कन www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> आइस कैप अंकुर प्लेट्स को कवर करने के लिए साफ़ प्लास्टिक lids </td></tr><tr><td> 3M शल्य चिकित्सा टेप micropore </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch व्यास स्टेनलेस स्टील गेंदों </td><td> हार्टफोर्ड टेक्नोलॉजीज, रॉकी हिल, सीटी </td><td> 034-006-1K </td><td> फसल के बाद रूट ऊतक बाधित खेतों में प्रयुक्त किए गए </td></tr><tr><td> 3 इंच लचीला बाल बैंड </td><td> स्थानीय किराने की दुकान </td><td></td><td> अंकुर प्लेट रूट प्लेट सुरक्षित </td></tr><tr><td> 4 मिमी व्यास लकड़ी skewers </td><td> स्थानीय किराने की दुकान </td><td></td><td> इन skewers आमतौर पर kabobs तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है </td></tr><tr><td> फिशर साइंटिफिक Nunc ब्रांड, मिलाना बिना 1-एमएल फ़िल्टर प्लेटों </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 278012 </td><td> 96 अच्छी तरह से नीचे में छेद के साथ अंकुर प्लेट्स. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96 खैर चिमनी लंबा पीसीआर प्लेट </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 14-230-242 </td><td> 96 अच्छी तरह से रूट प्लेट्स </td></tr><tr><td> अग्रवाल सेल संस्कृति परीक्षण </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4 Morpholinoethanesulfonic एसिड (एमईएस) </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige और (एमएस) बेसल नमक मिश्रण Skoog </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> आसान पील पन्नी सील गर्मी </td><td> ABgene संयुक्त राज्य अमेरिका </td><td> अटल बिहारी 0,745 </td><td> हीट रूट प्लेट्स ऊतकों के विघटन से पहले सील करने के लिए सील फिल्म </td></tr><tr><td> बतख ब्रांड अतिरिक्त वाइड पैकेजिंग टेप, 3.00 &quot;x 54.6 यार्ड </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> कोई आइटम. 21242139 </td><td> चिपकने वाला टेपसील भंडारण के लिए डीएनए के अर्क से युक्त microplates के लिए </td></tr><tr><td> सील रोलर </td><td> जैव - रेड </td><td> MSR-0001 </td><td> हाथ microplates पर चिपकने वाला सील टेप दबाने के लिए आयोजित रोलिंग उपकरण </td></tr><tr><td> 96 अच्छी तरह से धातु थर्मल ब्लॉक </td><td> कोल-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> ऊतक फसल के लिए रूट प्लेट्स फ्रीज करने के लिए खेतों में प्रयुक्त किए गए </td></tr><tr><td> वाटमान फ़िल्टर कागज </td><td> वाटमान इंटरनेशनल </td><td> 1002 090 </td><td> सतह स्टरलाइज़ बीज के लिए प्रयुक्त </td></tr><tr><td> प्रयोज्य पाश्चर पिपेट </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;डिस्पोजेबल पाश्चर विंदुक अंकुर प्लेट बीज स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया </td></tr><tr><td> Pyrex बेकिंग डिश (20 सेमी x 30 सेमी) </td><td> लक्ष्य विभाग के स्टोर </td><td></td><td> एक सूखी स्नान / बर्फ इथेनॉल निर्माण में प्रयुक्त किए गए. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

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Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

आइस कैप विधि एक 96 अच्छी तरह प्लेटें और गैर विध्वंस फसल जड़ ऊतक में प्रत्येक अंकुर से पौधों को विकसित करने के लिए अनुमति देता है. इस रूट ऊतकों से निकाली डीएनए जीनोटाइपिंग प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने पाया है कि आइस कैप के लिए अच्छी तरह से काम करता है<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, टमाटर, चावल और seedlings.

आइस कैप: बढ़ते के लिए एक विधि Arabidopsis और उच्च throughput जीनोटाइपिंग के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट्स में टमाटर संयंत्रों

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