Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio della National Science Foundation (codice di autorizzazione MCB-0447750).

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	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La calotta di ghiaccio metodo presentato qui uno scienziato permette di raccogliere campioni di tessuto da centinaia o addirittura migliaia di singole piante in un solo giorno ed efficiente estrarre il DNA genomico da questi campioni per l&#39;utilizzo in reazioni genotipizzazione. Dando uno scienziato individuo la possibilità di genotipo migliaia di piantine in un breve periodo di tempo, la calotta di ghiaccio metodo ha il potenziale di facilitare una serie di esperimenti genetici che altrimenti non sarebbero pratici da eseguire. Numerosi esempi sono forniti di seguito. <ol><li> Mappatura genetica. Scala fine mappatura genetica può essere accelerato se il ricercatore è in grado di identificare eventi di ricombinazione all&#39;interno di uno specifico intervallo lungo del cromosoma 3. Se questo intervallo comporta una distanza molto breve genetica, poi gli eventi di ricombinazione sarà relativamente rara nella popolazione mappatura segreganti. Per questo motivo, può essere necessario a migliaia schermo delle singole piante per trovare il re desideratoindividui ricombinanti. Questo processo potrebbe essere notevolmente accelerato mediante l&#39;utilizzo di Ice-Cap. Anche nell&#39;era del genoma ri-sequenziamento, è ancora necessario dimostrare direttamente che una mutazione è direttamente responsabile di un fenotipo di interesse. In questi casi, sarà necessario separare la mutazione di interesse lontano da altre mutazioni legate strettamente al fine di dimostrare una mutazione candidato è in realtà causale. In queste situazioni, Ice-Cap fornirebbe un metodo efficace per rompere il collegamento tra una coppia di mutazioni strettamente collegati. </li><li> Multi-mutanti. E &#39;diventato comune per i ricercatori che studiano Arabidopsis di combinare alleli mutanti di diversi loci distinti in un singolo individuo al fine di superare la ridondanza funzionale 4-6. Come esempio, consideriamo un caso in cui si vuole combinare alleli mutanti da quattro loci differenti in un singolo impianto attraverso incrocio genetico. Per questo progetto, sarà necessario generare unn individuo che è eterozigote in questi quattro loci come parte del sistema di attraversamento. Quando questo quadruplo eterozigote semi-set, il quadruplo omozigote dovrebbe essere presente al ritmo di uno su 256 nella popolazione risultante della progenie. Lo screening per questa persona rara con i metodi tradizionali sarebbe abbastanza laborioso. In confronto, con Ice-Cap per questo progetto avrebbe fornito lo scienziato con una strategia efficace per identificare i omozigote rara quadrupla in una sola generazione. </li><li> iTILLING. Il nostro laboratorio ha recentemente descritto un nuovo approccio allo screening per la presenza di mutazioni indotte nei geni di interesse in Arabidopsis 7. Questo metodo è una variante di una tecnica consolidata chiamata TILLING che viene utilizzato per trovare mutazioni nella popolazione ordinata di individui trattati con un mutageno chimico 8-10. Abbiamo chiamato il nostro metodo iTILLING perché è una versione personalizzata di TILLING che permette ad un individual scienziato a realizzare qualcosa che ha sempre richiesto un grande team di ricerca da completare. Ice-Cap costituisce parte integrante del metodo iTILLING 7, come descritto di seguito. </li></ol> L&#39;idea alla base iTILLING è quello di produrre una popolazione mutante effimero, che è in contrasto con le popolazioni resistenti mutante creato per i tradizionali progetti TILLING. Per iTILLING, i semi di una popolazione gonfiato M2 vengono seminati in blocchi di ghiaccio dal 50-100 Cap, e il DNA viene estratto utilizzando il ghiaccio-Cap metodo. Piantine di Arabidopsis vengono poi poste a 4 ° C mentre screening delle mutazioni viene eseguita utilizzando il ghiaccio-Cap DNA prep. Piantine di pomodoro sono conservati a 12 ° C.. Una volta piantine mutazioni portando desiderati sono stati identificati, sono recuperati dalla Ice-Cap piastre e trasferiti a terra. iTILLING non è destinato a fornire una lunga popolazione mutante per una comunità intera ricerca a schermo. Invece, iTILLING fornisce una strategia con la qualeuno scienziato può schermo una popolazione mutante su misura per le mutazioni in una manciata di geni in modo rapido, efficiente e ad un costo relativamente basso. Abbiamo trovato Ice-Cap di essere un metodo efficace per la coltivazione e la genotipizzazione Arabidopsis, il pomodoro e riso. Ci aspettiamo che le altre specie di piante devono essere suscettibili di Ice-Cap. Una limitazione sulla varietà di specie che possono essere ospitati da Ice-Cap è la dimensione dei semi. Solo le piante con semi abbastanza piccolo da entrare nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti sarà compatibile con calotta di ghiaccio nella sua attuale configurazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Macchina per scuotimento piastre Root per l&#39;estrazione del DNA </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0384 </td><td> Manuale di tenuta della macchina di calore utilizzato per lastre di root prima di disgregazione del tessuto </td></tr><tr><td> Centrifuga dotata di supporti per micropiastre oscillante </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Qualsiasi centrifuga con supporti per micropiastre oscillante sarebbe adatta </td></tr><tr><td> Microfill Dispenser per micropiastre </td><td> Biotek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Dispenser automatico di liquido per micropiastre riempimento </td></tr><tr><td> Bialetti marchio17x11 pollici Foglio commerciale Cookie Grandi </td><td> Obiettivo Department Store </td><td> www.bialetti.com </td><td> Questo strato di biscotto specifico è la profondità ideale per Ice-Cap </td></tr><tr><td> Custom Made Rack in metallo </td><td> Ferramenta </td><td></td><td> Cfr. il testo per la descrizione completa </td></tr><tr><td> 33 litri in plastica contenitore </td><td> Obiettivo Department Store </td><td> Sterilite Marca </td><td> Per Ice-Cap Fontana. Stoccaggio scatola di plastica abbastanza grande da contenere il foglio 17x11 cm cookies </td></tr><tr><td> 30 gallone Pompa Fontana ore </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Piccolo sommergibile pompa fontana disponibile nei negozi di giardino </td></tr><tr><td> Tubo per pompa fontana </td><td> Ogni laboratorio società di fornitura </td><td></td><td> Tubo compatibile con pompa fontana </td></tr><tr><td> Pinza in plastica </td><td> Ferramenta </td><td></td><td> Fascetta per tenere tubo cookiesfoglio </td></tr><tr><td> Coperchi di plastica trasparente dal basso Falcon Microtest piatto piastre a 96 pozzetti in polistirene </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Chiaro coperchi di plastica per la copertura di ghiaccio-Cap Piastre Seedling </td></tr><tr><td> 3M Micropore nastro chirurgico </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch diametro sfere in acciaio inox </td><td> Tecnologie Hartford, Rocky Hill, CT </td><td> 034-006-1K </td><td> Utilizzato per distruggere il tessuto radice dopo la raccolta </td></tr><tr><td> 3 bande pollici capelli elastici </td><td> Drogheria locale </td><td></td><td> Utilizzati per fissare Piastra Root to Plate Seedling </td></tr><tr><td> 4 spiedini di legno mm di diametro </td><td> Drogheria locale </td><td></td><td> Questi spiedini sono tipicamente utilizzati per la preparazione kabobs </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marchio, 1-mL piastre filtranti senza fritta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> 96-pozzetti Seedling con fori nella parte inferiore. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Well Tall-camino Piastre PCR </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-Root e Piastre </td></tr><tr><td> Agar - colture cellulari testati </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic acido (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige e Skoog (MS), miscela di sale basale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Peel calore facile tenuta foglio </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0745 </td><td> Calore pellicola sigillante per sigillare piastre radice prima di disgregazione del tessuto </td></tr><tr><td> Anatra Marca extra largo nastro di imballaggio, 3,00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Articolo no. 21242139 </td><td> Nastro adesivoper micropiastre sigillatura contenenti estratti di DNA per la conservazione </td></tr><tr><td> Tenuta Roller </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Mano lo strumento per lo stampaggio a rotazione nastro adesivo di tenuta su micropiastre </td></tr><tr><td> 96-blocco di metallo e termica </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Utilizzato per congelare le tavole Root per la raccolta dei tessuti </td></tr><tr><td> Carta da filtro Whatman </td><td> Whatman internazionale </td><td> 1002 090 </td><td> Utilizzato per le sementi superficie sterilizzazione </td></tr><tr><td> Pipetta Pasteur monouso </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;usa e getta pipetta Pasteur utilizzato per trasferire i semi per piastra Seedling </td></tr><tr><td> Pyrex teglia (20 cm x 30 cm) </td><td> Obiettivo Department Store </td><td></td><td> Usato per costruire una ghiaccio secco / etanolo da bagno. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

Sta diventando comune per gli scienziati impianto di sviluppare progetti che richiedono la genotipizzazione di un gran numero di piante. Il primo passo in qualsiasi progetto di genotipizzazione è quello di raccogliere un campione di tessuto da ogni singolo impianto. L&#39;approccio tradizionale a questo compito è quello di piante campione one-at-a-tempo. Se si vuole genotipo centinaia o migliaia di individui, tuttavia, usando questa strategia i risultati in un collo di bottiglia significativo in cantiere genotipizzazione. La calotta di ghiaccio metodo che descriviamo qui fornisce un elevato throughput soluzione a questa sfida, consentendo uno scienziato per la raccolta di tessuto da diverse migliaia di piantine in un solo giorno 1,2. Questo livello di velocità è reso possibile dal fatto che il tessuto viene raccolto da piante 96-at-a-tempo, piuttosto che un at-a-tempo. La calotta di ghiaccio metodo fornisce una piattaforma integrata per l&#39;esecuzione di crescita delle piantine, raccolta dei tessuti, e l&#39;estrazione del DNA. La base per Ice-Cap è la crescita di seedliNGS in un paio sovrapposti di piastre a 96 pozzetti. I pozzetti della piastra superiore contengono spine di media crescita agar su cui semenzali singoli germinare. Le radici crescono verso il basso attraverso i media agar, uscire la piastra superiore attraverso un foro, e passare in acqua piastra inferiore che contiene. Per la raccolta di tessuto per l&#39;estrazione del DNA, l&#39;acqua nella piastra inferiore contenente tessuto radice è rapidamente congelato, mentre le piantine nella piastra superiore rimanere a temperatura ambiente. La piastra superiore è poi staccato dalla piastra inferiore, si possa ottenere una piastra con 96 campioni di radice di tessuto congelato nel ghiaccio e un piatto con 96 piantine vitali. La tecnica si chiama &quot;Ice-Cap&quot; perché utilizza il ghiaccio per catturare il tessuto radice. La piastra a 96 pozzetti contenenti le piantine possono poi avvolto in un foglio e trasferiti a bassa temperatura. Questo processo sospende l&#39;ulteriore crescita delle piantine, ma non influenza la loro vitalità. Una volta che l&#39;analisi del genotipo è stata completata, piantine con il genotipo desiderato può essere trasferita dal 96-bene pin ritardo a terra per ulteriore moltiplicazione. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità del ghiaccio-Cap metodo utilizzando Arabidopsis thaliana, pomodoro, e le piantine di riso. Ci aspettiamo che il metodo deve essere applicabile anche ad altre specie di piante con semi abbastanza piccolo da entrare nei pozzetti di piastre a 96 pozzetti.

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Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

La calotta di ghiaccio metodo permette di coltivare le piante in piastre con 96 pozzetti e non distruttivo dei tessuti radice raccolta da ogni piantina. DNA estratto da questo tessuto radice può essere utilizzata per le reazioni di genotipizzazione. Abbiamo scoperto che Ice-Cap funziona bene per<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Pomodoro, e piantine di riso.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

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