Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

この作品は、国立科学財団（助成番号MCB - 0447750）からの助成金によって賄われていた。

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	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するアイスキャップ法は一日で、個々の植物の数百、または数千、から組織サンプルを収集し、効率的にタイピング反応で使用するために、これらのサンプルからゲノムDNAを抽出するためにある科学者が可能になります。個々の科学者を短期間で苗木の遺伝子型の数千に能力を与えることによって、アイスキャップ方式では、そうでない場合は実行するために実用的ではないと遺伝学的実験の数を容易にする可能性を秘めています。いくつかの例を以下に用意されています。 <ol><li> 遺伝的マッピング 。研究者は、第3染色体に沿って指定された時間内で組換えイベントを識別することができる場合ファインスケールの遺伝子マッピングが速くすることができます。この間隔が非常に短い遺伝的距離が含まれている場合は、その後の組換え現象は​​分離マッピング集団では比較的まれである。このような理由から、それは希望の再を見つけるために、個々の植物の数千をスクリーニングする必要がありますcombinant個人。このプロセスは、アイスキャップの使用により大幅に促進された可能性があります。であってもゲノムワイドな再シーケンシングの時代に、それが直接、特定の変異は、関心の表現型の直接の原因であることを実証するために依然として必要です。これらのケースでは、候補となる変異が実際に原因であることを証明するために、他の密接にリンクされている変異から離れて興味の変異を分離することが必要となります。このような状況では、アイスキャップはしっかりとリンクされている変異のペア間の結合を壊すための効率的な方法を提供するであろう。 </li><li> マルチ変異体 。それは、機能的な冗長性4-6を克服するために、単一の個体に複数の別個の遺伝子座から突然変異対立遺伝子を結合するためにシロイヌナズナを研究する研究者のために一般的になっています。例として、1つは遺伝的交雑を介して単一の植物に4つの異なった遺伝子座から突然変異対立遺伝子を結合した​​い場合を考えます。このプロジェクトでは、それが生成するために必要となる交差スキームの一部として、これらの4つの遺伝子座でヘテロ接合体であるn個の個々の。この四重ヘテロ接合体セットの種子は、四重ホモ接合体は子孫の結果として人口の256人に1人の割合で存在することが期待されているときに。伝統的な方法でこの珍しい個々のスクリーニングはかなりの手間になる。比較することにより、このプロジェクトのためにアイスキャップを使用すると、単一の世代に珍しい四重ホモ接合体を識別するための効率的な戦略と科学者を提供するでしょう。 </li><li> iTILLING。当研究室では最近、 シロイヌナズナ 7で目的の遺伝子の誘発突然変異の存在をスクリーニングするための新しいアプローチを説明した。このメソッドは、化学変異原80〜10で治療した患者の順序付けられた集団での変異を見つけるために使用されている耕起と呼ばれる確立された技術のバリエーションです。それがIND許可ティラーの個別バージョンであるため、我々はiTILLINGたちという名前のメソッドにしている伝統的に大規模な研究チームが完了するために必要としていますが何かを達成するためにividual科学者。後述するように氷のキャップは、iTILLING方法7の不可欠な部分を形成している。 </li></ol> iTILLINGの背後にある考え方は、伝統的な耕作のプロジェクト用に作成された耐久性のある変異体の集団とは対照的に立っている一時的な変異個体を、生成することです。 iTILLINGの場合は、筋肉隆々 M2集団から種子は、50から100アイスキャップのブロックに播種し、そしてDNAはアイスキャップ法を用いて抽出されます。 シロイヌナズナ実生は、4に配置されている° C変異のスクリーニングは、アイスキャップのDNAを使用して実行している間プレップ。トマトの苗を12℃で保存されます。苗運搬所望の変異が特定されたら、彼らはアイスキャッププレートから回収し、土壌に転送されます。 iTILLINGは、画面全体の研究コミュニティのための長期的な変異体集団を提供することを意図されていません。その代わり、iTILLINGはどのによって戦略を提供します。ある科学者は、効率的、かつ比較的低コストで、迅速に遺伝子の一握りの突然変異のためのカスタム変異個体を選別できます。 我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米を栽培し、ジェノタイピングのための効果的な方法であることがアイスキャップを発見した。我々は、植物の他の種がまたアイスキャップに従順であることを期待しています。アイスキャップに収容することができる、様々な種の1つの制限は、種子の大きさです。 96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ唯一の植物は、その現在の構成でアイスキャップと互換性があります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td>スペックス/ CertiPrep、メタチェン、ニュージャージー州</td><td> 2000ジェノ/グラインダー</td><td> DNA抽出のためにルートのプレートを振るための機械</td></tr><tr><td> ABgeneサーモシーラー</td><td> ABgene米国</td><td> AB - 0384 </td><td>組織破壊する前にルートのプレートに使用される手動のヒートシール機</td></tr><tr><td>スイングプレートキャリアを装備した遠心する</td><td>ベックマンコールター</td><td>アレグラ25R </td><td>スイングプレートキャリアを持つ任意の遠心は適して</td></tr><tr><td> MicroFillマイクロプレートディスペンサー</td><td> BioTekの www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td>マイクロプレートを埋めるための自​​動化された液体ディスペンサー</td></tr><tr><td> Bialettiブランド17x11インチ商用大型クッキーシート</td><td>ターゲットデパート</td><td> www.bialetti.com </td><td>この特定のクッキーシートは、アイスキャップのための理想的な深さを持っています</td></tr><tr><td>カスタムはメタルラックメイド</td><td>ハードウェアストア</td><td></td><td>完全な説明のテキストを参照してください。 </td></tr><tr><td> 33リットルのプラスチックの収納ボックス</td><td>ターゲットデパート</td><td> Steriliteブランド</td><td>アイスキャップの泉のため。 17x11インチのクッキーシートを保持するのに十分な大きさのプラスチック収納ボックス</td></tr><tr><td>時間噴水ポンプあたり30ガロン</td><td>デイトナ</td><td> 104506 </td><td>ガーデン用品店で入手可能な小型の水中噴水ポンプ</td></tr><tr><td>噴水ポンプ用ホース</td><td>あらゆるラボ供給会社</td><td></td><td>噴水のポンプと互換性のあるホース</td></tr><tr><td>プラスチック製のクランプ</td><td>ハードウェアストア</td><td></td><td>クッキーにホースを保持するクランプシートの</td></tr><tr><td>ファルコンマイクロテスト平底96ウェルのポリスチレンプレートから透明なプラスチックの蓋</td><td> BDファルコン www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td>アイスキャップの苗木のプレートをカバーするための透明なプラスチックの蓋</td></tr><tr><td> 3M細孔サージカルテープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch直径のステンレス鋼ボール</td><td>ハートフォードテクノロジーズ、ロッキーヒル、コネチカット州</td><td> 034から006 - 1K </td><td>収穫後の根の組織を妨害するために使用</td></tr><tr><td> 3インチの弾性ヘアバンド</td><td>地元の食料品店</td><td></td><td>苗のプレートにルートのプレートを固定するために使用</td></tr><tr><td>直径4mmの木製串</td><td>地元の食料品店</td><td></td><td>これらの串は、通常、kabobsを準備するために使用されます。 </td></tr><tr><td>フィッシャーサイエンティフィックヌンクブランド、フリットなし1 mLをフィルタープレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 278012 </td><td> 96ウェル底部の穴と苗のプレート。 </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96ウェルトール-チムニーPCRプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 14-230-242 </td><td> 96ウェルルートプレート</td></tr><tr><td>寒天 - 細胞培養テスト済み</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4 Morpholinoethanesulfonic酸（MES） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td>ムラシゲとスクーグ（MS）基底塩の混合物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M - 5524 </td><td></td></tr><tr><td>イージーピールのヒートシールホイル</td><td> ABgene米国</td><td> AB - 0745 </td><td>組織破壊する前にルートのプレートをシールするためのヒートシールフィルム</td></tr><tr><td>ダックのブランドエクストラワイド梱包形態テープ、3.00&quot;X 54.6ヤード</td><td>オフィスマックス www.officemax.com </td><td>項目なし。 21242139 </td><td>接着テープストレージのためのDNA抽出を含むシーリングマイクロプレート用</td></tr><tr><td>シーリングローラー</td><td> Bio - Rad社</td><td> MSR - 0001 </td><td>手は、マイクロプレートの上に粘着シールテープを押圧するための転造工具を開催</td></tr><tr><td> 96ウェル金属サーマルブロック</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 36400〜66 </td><td>組織の収穫のためのルートのプレートを凍結するために使用</td></tr><tr><td>ワットマンろ紙</td><td>ワットマンインターナショナル</td><td> 1002 090 </td><td>表面殺菌の種子のために使用</td></tr><tr><td>使い捨てパスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 13から678 - 6A </td><td> 5 ¾苗プレートに種を転送するために使用される&quot;使い捨てパスツールピペット</td></tr><tr><td>パイレックスグラタン皿（20センチ× 30センチ） </td><td>ターゲットデパート</td><td></td><td>ドライアイス/エタノール浴を構築するために使用。 </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

それは植物の多数の遺伝子型を必要とするプロジェクトを開発するための植物科学者のために一般的になりつつある。あらゆるジェノタイピングプロジェクトの最初のステップは、個々の植物から組織サンプルを収集することです。このタスクの伝統的なアプローチは、一度に1台ずつの植物をサンプリングすることです。個人の遺伝子型の数百または数千に1つの願いは、しかし、タイピングパイプラインの重要なボトルネックで、この戦略の結果を使用している場合。ここでは説明しているアイスキャップ法は、ある科学者が一日の1,2で数千本の苗木から組織を収集できるようにすることで、この課題へのハイスループットなソリューションを提供します。スループットのこのレベルは、組織はむしろ、一度に1台ずつではなく、96枚ごとの植物から収穫されているという事実によって実現されています。 アイスキャップ方式では、苗の成長、組織の収穫、およびDNAの抽出を行うための統合プラットフォームを提供します。アイスキャップのための基礎はseedliの成長です。96ウェルプレートの積層ペアのNGS。アッパープレートのウェルは、個々の苗が発芽する寒天の増殖培地のプラグが含まれています。ルーツは、寒天培地を下に成長する穴に通し、上部プレートを終了し、水を含む下側プレートに渡します。アッパープレートの苗は、室温でままDNA抽出のために組織を回収するために、ルートの組織を含む下側プレート内の水が急速に凍結されています。アッパープレートを氷と96実行可能な苗とワンプレートで凍結96ルートの組織サンプルを一つのプレートをもたらして、離れて下側プレートから剥離される。それがルートの組織をキャプチャするために氷を使用​​するための手法は、&quot;アイスキャップ&quot;という名前です。苗を含む96ウェルプレートは、ホイルで包み、低温に転送できます。このプロセスは、苗のさらなる成長を中断しますが、彼らの生存率には影響しません。遺伝子型の解析が完了したら、目的の遺伝子型を持つ苗木を96ウェルpから転送することができますさらなる伝播のための土壌に遅れて。我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米の苗を使ってアイスキャップ方式の有用性を実証している。我々は、メソッドはまた、96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ植物の他の種にも適用する必要があることを期待しています。

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Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

アイスキャップの方法は1つがそれぞれの苗から96ウェルプレートおよび非破壊的収穫根の組織で植物を育てることができます。このルートの組織から抽出したDNAは、遺伝子型の反応に使用することができます。我々は、アイスキャップがうまく機能することを発見した<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;、トマト、そして稲の苗。

アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナ</emハイスループットジェノタイピング用96ウェルプレートで>とトマト

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