Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Science Foundation (conceder número MCB-0447750).

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	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método Ice Cap-apresentada aqui permite que um cientista para coletar amostras de tecido de centenas ou mesmo milhares, de plantas individuais em um único dia e eficiente extrair o DNA genômico das amostras para uso em reações de genotipagem. Dando um cientista individual a capacidade de genótipo milhares de mudas em um curto período de tempo, o método Ice Cap-tem o potencial para facilitar uma série de experiências genéticas que não seriam práticos para executar. Vários exemplos são fornecidos abaixo. <ol><li> Mapeamento genético. Numa escala de mapeamento genético pode ser acelerada se o pesquisador é capaz de identificar eventos de recombinação dentro de um intervalo específico ao longo do cromossomo 3. Se este intervalo envolve uma distância muito curta genética, então os eventos de recombinação será relativamente raros na população de mapeamento segregação. Por esta razão, pode ser necessário para milhares de tela de plantas individuais para encontrar a desejada reindivíduos combinant. Este processo pode ser bastante acelerada com a utilização de Ice Cap-. Mesmo na era do genoma re-seqüenciamento, é ainda necessário demonstrar diretamente que uma mutação é diretamente responsável por um fenótipo de interesse. Nestes casos, será necessário segregar as mutações de interesse longe de outras mutações intimamente ligada a fim de provar uma mutação candidato é realmente causador. Nestas situações, Ice Cap-se proporcionar um método eficiente para a quebra de ligação entre um par de mutações intimamente ligados. </li><li> Multi-mutantes. Tornou-se comum para pesquisadores que estudam Arabidopsis para combinar alelos mutantes de vários loci distintos em um único indivíduo, a fim de superar a redundância funcional 4-6. Como exemplo, considere um caso em que se deseja combinar alelos mutantes de quatro loci diferentes em uma única planta por meio de cruzamento genético. Para este projeto, será necessário para gerar umn indivíduo que é heterozigoto para estas quatro loci como parte do esquema de cruzamento. Quando isso quadruple-heterozigoto semente sets, o homozigoto quadruple é esperado para estar presente a uma taxa de um em cada 256 na população resultante da progênie. Triagem para essa pessoa rara pelos métodos tradicionais seria muito trabalhoso. Por comparação, usando Ice Cap-para este projeto proporcionaria o cientista com uma estratégia eficiente para identificar o homozigoto rara quadruplicar em uma única geração. </li><li> iTILLING. Nosso laboratório descreveu recentemente uma nova abordagem para screening para a presença de mutações induzidas em genes de interesse em 7 Arabidopsis. Este método é uma variação de uma técnica estabelecida chamado Tilling que é usado para localizar mutações em populações ordenada de indivíduos tratados com um agente mutagénico química 8-10. Nós chamamos nosso método iTILLING porque é uma versão individualizada de cultivo que permite que um indcientista ividual para realizar algo que tradicionalmente tem exigido uma equipe de pesquisa grande para ser concluído. Ice Cap-faz parte integrante do método iTILLING 7, conforme descrito abaixo. </li></ol> A idéia por trás iTILLING é produzir uma população mutante efêmera, que contrasta com as populações duráveis ​​mutante criado para projetos de Tilling tradicionais. Para iTILLING, sementes de uma população bulked M2 são semeadas em 5-10 blocos Ice Cap, e DNA é extraído utilizando o método de Ice Cap-. Arabidopsis mudas são então colocadas a 4 ° C, enquanto triagem de mutação é realizada utilizando o DNA Ice Cap- preps. Mudas de tomate são armazenadas a 12 ° C.. Uma vez que mudas de portadores de mutações desejadas tenham sido identificadas, elas são recuperadas das placas Ice Cap-e transferidos para o solo. iTILLING não se destina a fornecer uma população mutante de longa duração para uma comunidade de pesquisa toda a tela. Em vez disso, iTILLING fornece uma estratégia pela qualum cientista pode tela de uma população mutante personalizado para mutações em um punhado de genes com rapidez, eficiência e com um custo relativamente baixo. Foram encontradas Ice Cap-de ser um método eficaz para o cultivo e genotipagem Arabidopsis, tomate e arroz. Esperamos que outras espécies de plantas devem também ser passíveis de Ice Cap-. Uma limitação na variedade de espécies que podem ser acomodados por Ice-Cap é o tamanho das sementes. Apenas as plantas com sementes pequenas o suficiente para caber em poços de uma placa de 96 poços será compatível com Ice Cap-na sua configuração actual.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Máquina para agitar Placas Root para a extração de DNA </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene EUA </td><td> AB-0384 </td><td> Manual da máquina de vedação térmico utilizado para Placas Root antes de rompimento do tecido </td></tr><tr><td> Centrífuga equipado com portadores de microplacas balançando </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Qualquer centrífuga com as operadoras de microplacas balançando seria adequado </td></tr><tr><td> Micropartículas Dispenser de microplacas </td><td> Biotek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Dispensador de líquido automatizado para microplacas enchimento </td></tr><tr><td> Bialetti marca17x11 polegadas assadeira comerciais de grande porte </td><td> Alvo Department Store </td><td> www.bialetti.com </td><td> Esta folha de cookie específico tem a profundidade ideal para Ice Cap- </td></tr><tr><td> Custom Made rack de metal </td><td> Loja de hardware </td><td></td><td> Veja o texto para descrição completa </td></tr><tr><td> 33 caixa de armazenamento Litro de plástico </td><td> Alvo Department Store </td><td> Sterilite Marca </td><td> Para Ice Cap-Fountain. Caixa de armazenamento de plástico grande o suficiente para segurar a assadeira 17x11 cm </td></tr><tr><td> 30 litros por hora Bomba Fountain </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Bomba submersível pequena fonte disponível em lojas da fonte do jardim </td></tr><tr><td> Mangueira para bomba da fonte </td><td> Qualquer empresa de fornecimento de laboratório </td><td></td><td> Mangueira compatível com a bomba da fonte </td></tr><tr><td> Braçadeira de plástico </td><td> Loja de hardware </td><td></td><td> Braçadeira para segurar mangueira para cookiesfolha </td></tr><tr><td> Limpar as tampas de plástico da Falcon fundo Microtest plana de 96 poços placas de poliestireno </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Limpar as tampas de plástico para cobrir Placas Ice Cap-Mudas </td></tr><tr><td> 3M esparadrapo micropore </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch diâmetro esferas de aço inoxidável </td><td> Hartford Technologies, Rocky Hill, CT </td><td> 034-006-1K </td><td> Usada para romper o tecido da raiz após a colheita </td></tr><tr><td> 3 polegadas elásticos de cabelo </td><td> Mercearia local </td><td></td><td> Usado para proteger Placa de raiz para Placa de Mudas </td></tr><tr><td> 4 milímetros de diâmetro espetos de madeira </td><td> Mercearia local </td><td></td><td> Estes espetinhos são tipicamente usados ​​para preparar espetinhos </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marca de 1 ml placas de filtro sem fritas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> Placas de 96 poços de Mudas com furos no fundo. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Bem Chimney Tall-Placa PCR </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> Placas de 96 poços Root </td></tr><tr><td> Agar - cultura de células testados </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4 Morpholinoethanesulfonic ácido (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige e Skoog (MS) mistura de sal basal </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Calor Peel fácil vedação folha </td><td> ABgene EUA </td><td> AB-0745 </td><td> Filme calor de vedação para vedação placas Root antes de rompimento do tecido </td></tr><tr><td> Duck Tape Embalagem Marca Extra Wide, 3,00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Item no. 21242139 </td><td> Fita adesivavedação de microplacas contendo extratos de DNA para o armazenamento </td></tr><tr><td> Rolo de vedação </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Mão ferramenta de rolamento para pressionar fita de vedação adesiva para microplacas </td></tr><tr><td> De 96 poços bloco de metal térmica </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Usado para congelar as Placas de raiz para a colheita de tecidos </td></tr><tr><td> Papel de filtro Whatman </td><td> Whatman Internacional </td><td> 1002 090 </td><td> Usado para esterilização de sementes de superfície </td></tr><tr><td> Descartáveis ​​Pasteur Pipeta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;descartáveis ​​pipeta Pasteur utilizado para a transferência de sementes para Placa de Mudas </td></tr><tr><td> Pyrex assadeira (20 cm x 30 cm) </td><td> Alvo Department Store </td><td></td><td> Usado para construir um banho de gelo / etanol seco. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

Está se tornando comum para os cientistas de plantas para desenvolver projetos que requerem a genotipagem de grande número de plantas. O primeiro passo em qualquer projeto de genotipagem é coletar uma amostra de tecido de cada planta individual. A abordagem tradicional para essa tarefa é para as plantas uma amostra-at-a-tempo. Se alguém deseja centenas genótipo ou milhares de indivíduos, no entanto, usando esta estratégia resulta em um gargalo significativo no pipeline genotipagem. O método Ice Cap-que descrevemos aqui oferece uma solução de alto rendimento a este desafio, permitindo que um cientista para coletar o tecido de vários milhares de mudas em um único dia, 1,2. Este nível de vazão é tornada possível pelo fato de que o tecido é colhido a partir de plantas 96-at-a-tempo, ao invés de um-em-um-tempo. O método Ice Cap-fornece uma plataforma integrada para a realização de um crescimento de mudas, a colheita de tecidos e extração de DNA. A base para Ice Cap-se o crescimento de seedlings em um par empilhadas de placas de 96 poços. Os poços da placa superior contêm fichas de ágar em que o crescimento de mudas individuais germinar. As raízes crescem para baixo através dos meios de ágar, sair da placa superior através de um buraco, e passar para uma água mais baixo da placa que contém. Para a colheita de tecidos para a extração de DNA, a água na parte inferior da placa contendo tecido raiz é rapidamente congelado, enquanto as mudas na placa superior permanecer em temperatura ambiente. A placa superior é, então, descoladas da placa inferior, resultando em um prato com 96 amostras de raízes tecido congelado em gelo e uma placa com 96 mudas viáveis. A técnica é chamada de &quot;Ice Cap-&quot; porque usa gelo para capturar o tecido radicular. A placa de 96 poços contendo as mudas pode, então, embrulhados em papel alumínio e transferidos para baixa temperatura. Este processo suspende um maior crescimento das mudas, mas não afeta a sua viabilidade. Pois a análise de genótipo foi concluída, as mudas com o genótipo desejado pode ser transferido do p de 96 poçostarde para o solo para a propagação ainda mais. Temos demonstrado a utilidade do método de Ice Cap-usando Arabidopsis thaliana, tomate, arroz e mudas. Esperamos que o método deve também ser aplicável a outras espécies de plantas com sementes pequenas o suficiente para caber nas cavidades da placas de 96 poços.

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Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

O método Ice Cap-permite cultivar plantas em placas de 96 poços e não-destrutiva do tecido raiz colheita de cada muda. DNA extraído dessa raiz tecido pode ser usado para reações de genotipagem. Descobrimos que Ice Cap-funciona bem para<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Tomate, mudas e arroz.

Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem

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