Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Эта работа финансировалась за счет гранта Национального научного фонда (грант № MCB-0447750).

<ol>
	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Ice-Cap метод, представленный здесь позволяет ученым собирать образцы тканей из сотен или даже тысяч отдельных растений в течение одного дня и эффективно извлекать геномной ДНК из этих образцов для использования в генотипирования реакций. Давая отдельного ученого способность генотипа тысяч саженцев в течение короткого периода времени, Ice-Cap метод имеет потенциал, чтобы облегчить количество генетических экспериментов, которые иначе не могли бы быть практичным для выполнения. Некоторые примеры приведены ниже. <ol><li> Генетическое картирование. Мелкомасштабные генетическое картирование может быть ускорено, если исследователь имеет возможность определить рекомбинации в пределах определенного интервала по хромосоме 3. Если этот интервал включает в себя очень короткий генетическое расстояние, то рекомбинация события будут относительно редки в разделении отображение населения. По этой причине, может быть необходимо, чтобы экран тысячи отдельных предприятий, чтобы найти нужную повторноcombinant лиц. Этот процесс может быть значительно ускоренную за счет использования Ice-Кап. Даже в эпоху генома повторное секвенирование, все-таки необходимо, чтобы непосредственно показать, что данный мутацию несет прямую ответственность за фенотип интерес. В этих случаях необходимо будет отделить мутации интерес от других тесно связаны мутации, чтобы доказать, кандидат мутации фактически причинным. В таких ситуациях, Ice-Cap обеспечит эффективный метод для взлома связь между парой тесно связаны мутации. </li><li> Multi-мутантов. Это стало общим для исследователей, изучающих Arabidopsis объединить мутантных аллелей из нескольких различных локусов в одной личности в целях преодоления функциональной избыточностью 4-6. В качестве примера, рассмотрим случай, когда кто-то хочет совместить мутантных аллелей из четырех различных локусов на одном заводе с помощью генной переправы. Для этого проекта нужно будет генерироватьн физическое лицо, является гетерозиготной по этим четырем локусам как часть пересечения схеме. Когда эта четверка-гетерозигот наборов семян, четырехместные гомозиготы как ожидается, будет присутствовать на курс одной из 256 в результате чего население потомства. Скрининг на этот редкий человек традиционными методами было бы весьма трудоемким. Для сравнения, с помощью Ice-Cap для этого проекта даст ученым с эффективной стратегии для выявления редких четырехместные гомозиготы в одном поколении. </li><li> iTILLING. В нашей лаборатории недавно описан новый подход к скрининга на наличие индуцированных мутаций в генах, интерес к Arabidopsis 7. Этот метод является вариацией на установленные технику, называемую обработкой, которая используется, чтобы найти мутации в упорядоченных популяции лиц обработанные химическими мутаген 8-10. Мы назвали наш метод iTILLING, потому что это индивидуальный вариант обработки почвы, что позволяет индividual ученым сделать что-то, что традиционно требуется большая исследовательская группа, чтобы закончить. Ice-Cap является неотъемлемой частью метода iTILLING 7, как описано ниже. </li></ol> Идея iTILLING является производство эфемерные мутант населения, которое резко контрастирует с прочным мутантных популяций создан для традиционной вспашки проектов. Для iTILLING, семена из наливных М2 населения высевают в 50 до 100 блоков Ice Cap, и ДНК извлекали с помощью Ice-Cap метод. Arabidopsis рассаду помещают при температуре 4 ° С, а мутация скрининг проводится с использованием Ice-Cap ДНК Готовые. Томатный саженцы хранятся при температуре 12 ° С.. Как только сеянцы проведения желаемой мутации были идентифицированы, они оправились от Ice-Cap плит и передано в почву. iTILLING не предназначен для обеспечения длительного мутант населения за весь научно-исследовательского сообщества экране. Вместо этого, iTILLING обеспечивает стратегию, котораяодин ученый не может экрана пользовательского мутант населения за мутации в нескольких генах быстро, эффективно, и при относительно низких затратах. Мы обнаружили, Ice-Cap быть эффективным методом для выращивания и генотипирования Arabidopsis, помидор, и рис. Мы ожидаем, что другие виды растений также должны поддаваться Ice-Кап. Одно из ограничений на различные виды, которые могут быть размещены на Ice-Cap является размер семян. Только растения с семенами достаточно небольшим по размеру в лунки 96-луночного планшета будут совместимы с ледяная шапка в ее нынешней конфигурации.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии (необязательно) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, Нью-Джерси </td><td> 2000 Гено / Grinder </td><td> Машина для встряхивания корневой пластины для выделения ДНК </td></tr><tr><td> ABgene Термо-Sealer </td><td> ABgene США </td><td> AB-0384 </td><td> Руководство заварены машина используется для корневой пластины до ткани нарушения </td></tr><tr><td> Центрифуга оснащена размахивая носителей микропланшетов </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Любая центрифуга с качающимися носителей планшет был бы подходящим </td></tr><tr><td> MicroFill микропланшетов Диспенсер </td><td> Biotek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Автоматизированная жидкости дозатор для заполнения микропланшетов </td></tr><tr><td> Bialetti бренда17x11 дюймовый коммерческий большой лист печенья </td><td> Целевая универмаг </td><td> www.bialetti.com </td><td> Этот специфический для выпечки имеет идеальную глубину Ice-Cap </td></tr><tr><td> Сшитое Металл стойку </td><td> Хозяйственном магазине </td><td></td><td> См. текст для полного описания </td></tr><tr><td> 33 литров ящик для хранения пластиковых </td><td> Целевая универмаг </td><td> Sterilite Марка </td><td> Для Ice-Cap фонтана. Пластиковый ящик для хранения достаточно большой для хранения 17x11 дюймовый лист печенья </td></tr><tr><td> 30 литров в час насос фонтана </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Малый фонтан погружных насосов доступны в магазинах сада питания </td></tr><tr><td> Шланг для фонтана насос </td><td> Любая компания, лаборатории питания </td><td></td><td> Шланг совместимы с фонтаном насоса </td></tr><tr><td> Пластиковый зажим </td><td> Хозяйственном магазине </td><td></td><td> Зажим держать шланг, чтобы печеньелист </td></tr><tr><td> Прозрачная пластиковая крышка от Сокола Микротест плоское дно 96-луночных полистирола </td><td> BD Сокол www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Прозрачная пластиковая крышка для покрытия Ice-Cap Плиты рассады </td></tr><tr><td> 3M микропоры хирургической лентой </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch диаметра из нержавеющей стальных шариков </td><td> Хартфорд технологий, Роки-Хилл, штат Коннектикут </td><td> 034-006-1K </td><td> Используется для нарушать корневой ткани после сбора урожая </td></tr><tr><td> 3-дюймовый Резинки волос </td><td> Местном продуктовом магазине </td><td></td><td> Используется для крепления корневой пластины для рассады пластины </td></tr><tr><td> Диаметром 4 мм, деревянные шампуры </td><td> Местном продуктовом магазине </td><td></td><td> Эти шампуры, как правило, используется для подготовки kabobs </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc бренда, 1-мл фильтр пластины без фритты </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> 96-луночного Саженец пластин с отверстиями в дне. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Ну Талл-Дымоход ПЦР пластины </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-луночных корневой </td></tr><tr><td> Агар - культура клеток испытания </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic кислоты (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Мурасиге и Скуга (MS) базальной смесью соли </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> М-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Легкое тепло Пил уплотнения фольги </td><td> ABgene США </td><td> AB-0745 </td><td> Тепло герметизирующая пленка для герметизации корневого пластины до ткани нарушения </td></tr><tr><td> Duck Марка Очень широкие ленты Упаковка, 3,00 &quot;х 54,6 ярдов </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Пункт нет. 21242139 </td><td> Скотчдля герметизации планшеты, содержащие ДНК экстракты для хранения </td></tr><tr><td> Уплотнительная роликовые </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Ручной инструмент для прокатки нажатием клейкой лентой уплотнения на микропланшетов </td></tr><tr><td> 96-луночного металла тепловой блок </td><td> Коул-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Используется для заморозки корневой пластины для ткани урожая </td></tr><tr><td> Ватман Фильтровальная бумага </td><td> Ватман Международного </td><td> 1002 090 </td><td> Используется для поверхностной стерилизации семян </td></tr><tr><td> Одноразовые пипетки Пастера </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;одноразовые пипетки Пастера, используемые для перемещения семян на рассаду пластины </td></tr><tr><td> Pyrex для выпечки (20 см х 30 см) </td><td> Целевая универмаг </td><td></td><td> Используется для построения сухой лед / этанол ванну. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

Это становится общей для завода ученым разработать проекты, которые требуют генотипирование большого числа растений. Первым шагом в любом генотипирования проекта является сбор образца ткани из каждого отдельного растения. Традиционный подход к этой задаче является образцом растения одну за один раз. Если кто-то хочет генотип сотни или тысячи людей, однако, использование этой стратегии приводит к значительному узким местом в генотипирования трубопровода. Ice-Cap метод, который мы описываем здесь обеспечивает высокую пропускную способность решение этой проблемы, позволяя одному ученому собрать ткани от нескольких тысяч саженцев в одном 1,2 дня. Этот уровень пропускной способности стало возможным благодаря тому, что ткань собирают из растений, 96-в-времени, а не один-на-времени. Ice-Cap метод обеспечивает интегрированную платформу для выполнения рост проростков, ткани урожая, и выделения ДНК. Основой для Ice-Cap является рост seedliNGS в стек пару 96-луночных планшетах. Скважинах верхней пластины содержат разъемы агар питательной среды, на которой отдельные саженцы прорастают. Корни растут вниз через агар СМИ, выход верхней пластины через отверстие, и пройдите в нижнюю пластину, содержащую воду. Для уборки ткани для выделения ДНК, вода в нижней пластины, содержащей корневой ткани быстро замороженных в то время как сеянцы в верхней пластины остаются при комнатной температуре. Верхняя пластина затем очищенные от нижней плиты, уступив одну пластину с 96 корневых образцы тканей замороженной во льду и одну пластину с 96 жизнеспособных сеянцев. Техника под названием &quot;Ice-Кап&quot;, поскольку он использует лед, чтобы захватить корневой ткани. 96-луночного планшета содержащие саженцев может, завернутые в фольгу и переданы низкой температуре. Этот процесс приостанавливает дальнейший рост рассады, но не влияет на их жизнеспособность. После анализа генотипа была завершена, саженцы с желаемым генотипом могут быть перенесены из 96-и рпоздно, чтобы почва для дальнейшего размножения. Мы продемонстрировали полезность Ice-Cap метод с использованием Arabidopsis thaliana, помидор и риса саженцы. Мы ожидаем, что метод должен быть применим и к другим видам растений с семенами достаточно небольшим по размеру в лунки 96-луночных планшетах.

Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap метод позволяет выращивать растения в 96-луночных планшетах и ​​непагубно урожая корневой ткани друг от рассады. ДНК, извлеченной из этого корня ткани могут быть использованы для генотипирования реакций. Мы обнаружили, что ледяная шапка хорошо работает для<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Томаты, и рассаду риса.

Ice-Кап: метод выращивания Arabidopsis И томатов в 96-луночных планшетах для высокопроизводительного генотипирования

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Пиросеквенирования: Простой метод для точного генотипирования

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Высокая пропускная метод для криоконсервации спермы и данио рерио In Vitro Оплодотворение

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Быстрое высокой пропускной метод картирования рибонуклеопротеиды (мяРНП) по правам пре-мРНК

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Измерение пространственных и временных Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в Arabidopsis растений

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Измерение окислительного стрессоустойчивость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В микротитровальных пластинках 96-а

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Свет лист флуоресцентной микроскопией корней растений, растущих на поверхности геля

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...