Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por una beca de la National Science Foundation (número de concesión MCB-0447750).

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	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de capa de hielo que aquí se presenta permite a un científico para recoger muestras de tejidos de cientos o incluso miles de plantas individuales en un solo día y eficiente extracción de ADN genómico de las muestras para su uso en reacciones de genotipado. Al dar un científico de la capacidad de determinar el genotipo de miles de plántulas en un período corto de tiempo, el método de capa de hielo tiene el potencial de facilitar una serie de experimentos genéticos que de otro modo no sería práctico para llevar a cabo. Varios ejemplos se proporcionan a continuación. <ol><li> Mapeo genético. A escala fina elaboración de mapas genéticos se puede acelerar si el investigador es capaz de identificar los eventos de recombinación dentro de un intervalo específico a lo largo del cromosoma 3. Si este intervalo implica una distancia genética muy corto, entonces los eventos de recombinación será relativamente poco frecuente en la población de mapeo segregar. Por esta razón, puede ser necesario a miles de pantalla de las plantas individuales para encontrar el re deseadocombinant personas. Este proceso puede ser acelerado en gran medida a través del uso de la capa de hielo. Incluso en la era del genoma de toda la re-secuenciación, todavía es necesario demostrar directamente que una mutación es directamente responsable de un fenotipo de interés. En estos casos, será necesario separar la mutación de interés lejos de otras mutaciones estrechamente vinculada con el fin de demostrar una mutación candidato es realmente causal. En estas situaciones, capa de hielo podría proporcionar un método eficaz para romper la vinculación entre un par de mutaciones estrechamente vinculados. </li><li> Multi-mutantes. Se ha vuelto común para los investigadores que estudian la Arabidopsis para combinar los alelos mutantes de varios loci distintos en una sola persona con el fin de superar la redundancia funcional 4-6. Como ejemplo, considere un caso en el que se desea combinar los alelos mutantes de cuatro lugares diferentes en una sola planta a través del cruce genético. Para este proyecto, será necesario generar unn individuo que es heterocigoto en estos cuatro lugares, como parte del programa de cruce. Cuando esta semilla cuádruple heterocigoto conjuntos, el homocigoto cuádruple se espera que estén presentes en una proporción de uno de cada 256 en la población resultantes de la progenie. La detección de esta persona rara por los métodos tradicionales sería muy laborioso. En comparación, el uso de hielo-Cap para este proyecto proporcionaría el científico con una estrategia eficiente para la identificación de los homocigotos cuádruple raro en una sola generación. </li><li> iTILLING. Nuestro laboratorio ha descrito recientemente un nuevo enfoque para la detección de la presencia de mutaciones inducidas en los genes de interés en Arabidopsis 7. Este método es una variación de una técnica establecida llamada labranza que se utiliza para encontrar mutaciones en las poblaciones ordenada de los individuos tratados con un mutágeno químico 80-10. Hemos llamado a nuestro método iTILLING porque es una versión individualizada de labranza que permite una individual científico para lograr algo que tradicionalmente ha requerido un equipo de investigación grande para completar. Capa de hielo que forma parte integrante del método iTILLING 7, tal como se describe a continuación. </li></ol> La idea detrás de iTILLING es para producir una población efímera mutante, lo que contrasta con la población mutante resistente creado para los proyectos tradicionales de labranza. Para iTILLING, las semillas de una población M2 granel se siembran en 50 de 100 bloques de hielo Cap, y se extrae el ADN utilizando el método de capa de hielo. Plántulas de Arabidopsis se colocan a 4 ° C, mientras que la detección de mutaciones se realizó mediante el ADN capa de hielo preparaciones. Plántulas de tomate se almacenan a 12 ° C.. Una vez que las plántulas portadoras de mutaciones deseadas han sido identificados, que se recuperan de las placas de capa de hielo-y trasladados a tierra. iTILLING no está destinada a proporcionar a una población mutante de larga duración para una comunidad de investigación a la pantalla. En cambio, iTILLING proporciona una estrategia mediante la cualuno de los científicos pueden detectar una población de encargo mutante para las mutaciones en un puñado de genes rápida, eficiente ya un costo relativamente bajo. Hemos encontrado capa de hielo de ser un método eficaz para el crecimiento y el genotipo de Arabidopsis, tomate y arroz. Esperamos que otras especies de plantas también deben ser susceptibles de capa de hielo. Una limitación en la variedad de especies que pueden ser atendidas por capa de hielo del tamaño de las semillas. Sólo las plantas con semillas pequeñas como para caber en los pocillos de una placa de 96 y será compatible con la capa de hielo en su configuración actual.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, Nueva Jersey </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Máquina para sacudir las placas de raíz para la extracción de ADN </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sellador </td><td> ABgene EE.UU. </td><td> AB-0384 </td><td> Manual de sellado al calor de la máquina utilizada para las placas de raíz antes de la ruptura del tejido </td></tr><tr><td> Centrífuga equipada con soportes de microplacas balanceo </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Cualquier centrífuga con soportes de microplacas balanceo sería adecuado </td></tr><tr><td> Microrrelleno microplacas Dispensador </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Dispensador de líquido automatizado para microplacas de relleno </td></tr><tr><td> Bialetti marca17x11 cm Hoja comercial para galletas </td><td> Objetivo de los grandes almacenes </td><td> www.bialetti.com </td><td> Esta hoja de cookie en cuestión tiene la profundidad ideal para la capa de hielo </td></tr><tr><td> Por encargo del estante de metal </td><td> Hardware Store </td><td></td><td> Véase el texto para una descripción completa </td></tr><tr><td> 33 litros de plástico caja de almacenamiento </td><td> Objetivo de los grandes almacenes </td><td> Sterilite Marca </td><td> Para fuente de hielo-Cap. Caja de plástico suficientemente grande para contener la hoja de 17x11 pulgadas galletas </td></tr><tr><td> 30 galones por hora bomba de la fuente </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Pequeña bomba sumergible fuente disponible en las tiendas de jardinería </td></tr><tr><td> Manguera para bomba de la fuente </td><td> Cualquier empresa de suministro de laboratorio </td><td></td><td> Manguera compatible con la bomba de la fuente </td></tr><tr><td> Abrazadera de plástico </td><td> Hardware Store </td><td></td><td> Pinza para sostener la manguera para galletashoja </td></tr><tr><td> Claro tapas de plástico de fondo Falcon Microtest plana placas de 96 pocillos de poliestireno </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Claro tapas de plástico para cubrir Hielo-Placas de plántulas </td></tr><tr><td> 3M microporos cinta quirúrgica </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch bolas de diámetro de acero inoxidable </td><td> Hartford Technologies, Rocky Hill, CT </td><td> 034 a 006-1K </td><td> Se utiliza para interrumpir el tejido de la raíz después de la cosecha </td></tr><tr><td> 3 bandas elásticas pulgadas del cabello </td><td> Tienda de comestibles </td><td></td><td> Se utiliza para fijar disco de la raíz de plántulas Plate </td></tr><tr><td> 4 pinchos de madera diámetro mm </td><td> Tienda de comestibles </td><td></td><td> Estas brochetas se utilizan normalmente para preparar brochetas </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marca de 1 ml, sin placas de filtro frita </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> Placas de 96 pocillos de plántulas con agujeros en el fondo. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Bueno Tall-Chimenea PCR Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> Placas de 96 pocillos de raíz </td></tr><tr><td> Agar - cultivo de células de prueba </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic ácido (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige y Skoog (MS) mezcla de sal basal </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Easy Peel calor de sellado de aluminio </td><td> ABgene EE.UU. </td><td> AB-0745 </td><td> El calor la lámina de sellado para el sellado de las placas de raíz antes de la ruptura del tejido </td></tr><tr><td> Marca de pato extra de cinta de embalaje ancho, 3.00 &quot;x 54.6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Artículo no. 21242139 </td><td> Cinta adhesivapara microplacas de sellado que contiene extractos de ADN para el almacenamiento </td></tr><tr><td> Sellado de rodillos </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Herramienta de mano móvil para presionar precinto adhesivo en microplacas </td></tr><tr><td> De 96 pozos térmicos de metales bloque </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Se utiliza para congelar las placas de la raíz para la cosecha del tejido </td></tr><tr><td> Papel de filtro Whatman </td><td> Whatman International </td><td> 1002 090 </td><td> Se utiliza para esterilizar la superficie de las semillas </td></tr><tr><td> Desechables con una pipeta Pasteur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 a 678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;desechables pipeta Pasteur utilizados para la transferencia de semillas a las plántulas Plate </td></tr><tr><td> Pyrex plato para hornear (20 cm x 30 cm) </td><td> Objetivo de los grandes almacenes </td><td></td><td> Se utiliza para construir un hielo seco / etanol baño. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

Cada vez es más común para los científicos de plantas para desarrollar proyectos que requieren el genotipado de un gran número de plantas. El primer paso en cualquier proyecto de genotipado es recoger una muestra de tejido de cada planta individual. El enfoque tradicional para esta tarea es una muestra de las plantas-en-un-tiempo. Si se desea cientos genotipo o de miles de personas, sin embargo, con esta estrategia da como resultado un importante cuello de botella en la tubería de genotipado. El método de capa de hielo que se describe aquí, proporciona una solución de alto rendimiento para este reto al permitir que un científico para recoger tejidos de varios miles de plántulas en un solo día 1,2. Este nivel de rendimiento es posible gracias al hecho de que el tejido se extrae de plantas de 96 a-un-tiempo, en lugar de uno-a-un-tiempo. El método de capa de hielo ofrece una plataforma integrada para la realización de crecimiento de las plántulas, la cosecha de tejidos, y la extracción de ADN. La base de la capa de hielo es el crecimiento de seedliNGS en un par apilado de placas de 96 pocillos. Los pozos de la placa superior contiene los enchufes de los medios de cultivo de agar en el que las plántulas individuales germinar. Las raíces crecen hacia abajo a través de los medios de agar, la salida de la placa superior a través de un agujero, y pasar a una placa inferior que contiene agua. Para la cosecha de tejidos para la extracción de ADN, el agua en la placa inferior que contiene tejido de la raíz se congela rápidamente, mientras que las plantas de semillero en la placa superior permanecer a temperatura ambiente. La placa superior es entonces despegar de la placa inferior, dando una placa con 96 muestras de raíces de tejido congelado en el hielo y una placa con 96 plantas viables. La técnica es llamada &quot;capa de hielo&quot;, ya que utiliza el hielo para capturar el tejido de la raíz. La placa de 96 pocillos que contienen las semillas se puede envueltas en papel y transferida a baja temperatura. Este proceso se suspende un mayor crecimiento de las plántulas, pero no afecta su viabilidad. Una vez que el análisis del genotipo se ha completado, las plantas con el genotipo deseado puede ser transferido de la p-96, asía finales de suelo para la propagación. Hemos demostrado la utilidad del método de capa de hielo con Arabidopsis thaliana, tomate y semillas de arroz. Esperamos que el método debería ser aplicable también a otras especies de plantas con semillas pequeñas como para caber en los pocillos de placas de 96 pocillos.

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Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

El método de capa de hielo permite cultivar plantas en placas de 96 pocillos y no destructiva del tejido de la cosecha de raíz de cada planta. ADN extraído de este tejido de la raíz puede ser utilizado para las reacciones de genotipado. Hemos encontrado que la capa de hielo que funciona bien para<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Tomate y semillas de arroz.

Capa de hielo: Un método para el cultivo Arabidopsis Y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado

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