Name: ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Detta arbete har finansierats genom anslag från National Science Foundation (licensnummer MCB-0.447.750).

1. Förbered Ice-Cap Seedling Tavlor med Media Agar tillväxt Smält tillväxt medier (0,5 x Murashige och Skoog (MS) basala salt blandning, 2 mm Morpholinoethanesulfonic syra (MES), 0,6% agar (w / v), pH 5,7) har droppats in autoklaveras Seedling Plattor med en Dispenser MicroFill mikroplattor. En liter av media som behövs per 18 Seedling plattor. <ol><li> Förbered tillväxt media i en liters glasflaskor med skruvlock lock och autoklav i 20 minuter. </li><li> Autoklav en liter destillerat vatten i en glasflaska med skruvlock lock. Samtidigt har också autoklav tom Seedling Plates insvept i aluminiumfolie. </li><li> Överför autoklaveras media och vatten till en inkubator vid 65 ° C. Denna temperatur kommer att upprätthålla tillväxten media i ett smält tillstånd. </li><li> Efter autoklavering, ta bort Seedling plåtar från folie och lägg i laminärt flöde huva för att torka. Plattorna måste vara helt torr innan du fortsätter så att limmet förpackningstejpen kanhelt täta hålen på botten av brunnarna i plattorna. </li><li> Torka lab bänk med 95% etanol att sanera. </li><li> Blötlägg klar plast lock för plantan plattorna i 95% etanol att sanera. Ta bort locken från etanol och lufttorka i laminärt flöde huva. Autoklavera inte plastlock att sterilisera dem eftersom de smälter i autoklav. </li><li> Applicera förpackningstejp till botten i varje Seedling Plate och fast tätningen med hjälp av rullen verktyget. </li><li> Placera flaskorna av smält tillväxt media och sterilt vatten i ett vattenbad vid 65 ° C. </li><li> Bifoga en flaska som innehåller 70% etanol i rumstemperatur till MicroFill maskinen och köra utrensning cykeln två gånger för att sanera VVS i MicroFill maskinen. </li><li> Sätt flaskan med sterilt vatten till MicroFill maskinen. Kör utrensning cykeln sex gånger för att värma rören och rensa etanol ur systemet. Flaskan med vatten bör finnas kvar i 65 ° C badet under hela detta förfarande. </li><li> Efter genomgången utrensningarna med sterilt vatten, omedelbart fäster flaskan av smält tillväxt media till MicroFill maskinen. Kör utrensning cykeln två gånger för att rensa destillerat vatten ur rören. Flaskan av tillväxt media bör vara kvar i 65 ° C badet hela detta förfarande. </li><li> Tillsätt 450 mikroliter av tillväxt medier i brunnar på varje Seedling Plate. Arbeta snabbt så att tillväxten media inte stelna i rörsystemet i MicroFill maskinen. </li><li> När alla plantan plattor har fyllts omedelbart fäster flaskan på 65 ° C sterilt vatten till MicroFill maskinen och köra utrensning cykel 12 gånger för att rengöra VVS. Flaskan med vatten bör finnas kvar i 65 ° C badet hela detta förfarande. </li><li> Om en MicroFill maskin inte är tillgänglig, kan Seedling Plattor också vara beredda för hand-pipettering smält agar i den förseglade plattorna med hjälp av en flerkanalspipett. </li><li> Inspektera brunnar varje Seedling Plates to se till att tillväxten media inte har läckt ut ur alla brunnar. Hand pipett ytterligare smält tillväxt medier i enskilda brunnar behövs. </li><li> Täck varje tallrik med en klar plast lock, och låt tillväxt media att stelna i plantan Plattor i rumstemperatur. Stack tallrikar och slå in i aluminiumfolie för förvaring vid 4 ° C. Förvara plattorna upp och ned för att förhindra att vatten samlas i brunnarna under lagring. </li></ol> 2. Så frön till is-Cap Seedling plattor och gro plantor Vi har tidigare beskrivit en semi-automatiserad metod för dispensering Arabidopsis frön i Seedling Plattor med hjälp av en anordning frö belastning (2). Även denna enhet kan vara användbart för vissa partier av utsäde, har vi funnit att variationen i utsädet storlek visas av olika partier av Arabidopsis frön begränsar den allmänna nyttan av denna enhet. Vi är i färd med att utveckla en alternativ automatisk metod för utsäde dispensering, but För närvarande har vi funnit att den mest effektiva strategin för dispensering frön i plantan Plattorna är att utföra detta steg för hand som beskrivs nedan. <ol><li> Strö torra frön på Whatman filterpapper. </li><li> Fördela 95% etanol på frön så att alla frön är täckta med etanol. Denna behandling kommer ytan sterilisera fröna. </li><li> Låt frön lufttorka. </li><li> Överför enskilda frön i brunnarna i plantan Plates hjälp av en modifierad disponibel glas pasteurpipett. I slutet av pasteurpipett tätas genom flambering spetsen. Den resulterande glas spets fuktas genom att försiktigt trycka till agar media, vilket möjliggör ett enda frö vara lätt plockas upp och överföras till ytan av agar i brunnarna i plantan Plate. En dubbel-headed version av detta frö plätering verktyg kan också användas för att öka genomströmningen. </li><li> Täck varje Groddplanta tavla med en tydlig plast lock och tätning med Micropore kirurgtejp. Linda staplade plattormed aluminiumfolie och förvara frön Arabidopsis vid 4 ° C i fyra dagar att stratifiera fröna och synkronisera groning. Tomat frön bör förvaras i mörker vid 12 ° C under fyra dagar. </li><li> Placera plantan Plattor i lysrörsbelysning vid 18 ° till 20 ° C för att initiera grobarhet. </li></ol> 3. Överföring Groddplanta plattorna Ice-Cap Fountain Efter att plantan Plattor har varit under ljus i fyra dagar, överföring plantan Plattor till Ice-Cap fontän. För Arabidopsis, är plantorna vanligtvis kvar i Ice Cap fontänen i 10 till 14 dagar. <ol><li> Montera Ice-Cap Fountain genom att placera en cookie blad på toppen av egna rack struktur som har placerats i en förvaringslåda av plast. Använd utjämning nötter för att justera nivån på cookie blad. Placera en dränkbar pump i förvaringsbox och fäst ut slangen från pumpen till sidan av cookie blad med hjälp av en fjäderbelastad CLAmp. Montera Ice-Cap Fountain på en hylla i växternas tillväxt rum eller tillväxt kammare så att ytan på Ice-Cap Fountain får direkt lysrör. </li><li> Fyll Ice-Cap Fountain med en blandning av 3 delar destillerat vatten till 1 del kranvatten. Vatten bör läggas till i fontänen tills den dränkbara pumpen är flera centimeter under vattenytan. Markera den slutliga vattennivån i förvaringslåda av plast med hjälp av lab tejp och en märkpenna. </li><li> Förbered Root Plattor genom att lägga till en 3/32-inch diameter stålkula i varje brunn på en Root Plate. </li><li> Den rostfria kulor kan läggas till i Root Plattor med en skräddarsydd boll dispensering enhet 1. Denna enhet är tillverkad genom att placera ett ark aluminiumfolie över ytan av en 96-väl PCR-platta och med en märkpenna för att markera de platser i centrum för varje brunn på ytan av folien. Detta markerade ark folie placeras sedan ovanpå ytterligare 6 ark av aluminium förIL och lindade runt den släta ytan av ett lock från en begagnad pipettspets rutan. En kraftig verktyg som en trä spett används sedan för att skapa en torva stor nog att rymma en enda metall boll vid varje av de 96 positionerna. För att fylla denna dosering enhet med bollar, finns ett överskott av metallkulor hälls över enheten och det är försiktigt skakas för att avlägsna överskott bollar. Root tavla placeras sedan över toppen av utlämning enheten, som välte att släppa en boll i varje brunn på Root Plate. </li><li> Tillsätt 340 mikroliter av en blandning av 3 delar destillerat vatten till 1 del kranvatten till varje brunn på Root tavla med MicroFill maskin. Se till att stålkulor har lagts till i Root skivorna innan dispensering vattnet. </li><li> Skala självhäftande film från botten av plantan plattor och Ta bort plasthöljet locken från plattorna. Placera varje Groddplanta tavla i en Root tavla med en metall kula och vatten och fäst de två plattorna ihop med två elastiska hair band. </li><li> Placera staplade Ice-Cap plattor i Ice-Cap Fountain. Den tydliga plastlock bör inte användas när plattorna är i Ice-Cap Fountain. Kontrollera att se till att såväl A-01 av plantan tavla är i linje med såväl A-01 av Root Plate. </li><li> De staplade Groddplanta / Root Plattor bör lämnas i Ice-Cap Fountain tills majoriteten av plantor ha root vävnad som har trängt in i Root plattorna. Den idealiska tillväxten temperatur för Arabidopsis plantor i Ice-Cap Fountain är ca. 18 ° C. Vattennivån i den cookie blad skall vara sådan att vatten kan flöda in i brunnarna i Root Tallrikar, men inte så djupt att plantor i plantan Plate är under vatten. Om vattennivån inte är korrekt måste du få en annan cookie blad av rätt djup. </li><li> Tillsätt destillerat vatten regelbundet till Ice-Cap Fountain att behålla den ursprungliga vattennivån. Genom att lägga till rent destillerat vatten till fontänen du kommer att ersättavätska förlorade på grund av avdunstning utan att ändra mineralsammansättning av vattnet i fontänen. Vatten nivån bör kontrolleras dagligen i Ice-Cap Fountain. </li></ol> 4. Harvest Root Tissue Root vävnad skördas genom att frysa vattnet i Root tavla och sedan peeling plantan tavla borta från roten Plate. <ol><li> Dagen före skörd rot vävnad, ta bort de staplade Ice-Cap plåtar från Ice-Cap Fountain. </li><li> Sätt tre träspett mellan brunnarna i staplade Seedling och tallrikar Root. Syftet med grillspett är att höja spetsar av plantan Plattor ur brunnarna i Root Plates inför frysning processen. </li><li> Låt staplade Ice-Cap Tavlor med träspett infogas stå över natten i ljus. Detta inkubation gör liten avdunstning av vätska i Root Tallrikar, vilket underlättar den efterföljande frysning och platta processer separation. </li><li> Pådagen av vävnad skörd, förbereder en frysning bad. Placera en 96-bra metal termisk block i en Pyrex skålen med blandning av torr is och 95% etanol. Låt den termiska blocket till jämvikt i temperatur för ca. 20 minuter. Placera Pyrex skålen ovanpå någon typ av isolerande material, t.ex. en autoklav vanten så att den låga temperaturen inte skadar ytan på lab bänk. </li><li> Placera staplade Ice-Cap plattor med träspett i kylda termiska blocket och inkubera i 5 minuter. Under denna tid vattnet i Root Plate kommer att frysa fast. Plantorna i plantan tavla fryser inte under denna behandling och vara helt genomförbart. </li><li> Ta bort de staplade Ice-Cap plattor från termisk blocket och placera dem på labbet bänken vid rumstemperatur. Ta bort elastiska band träspett från staplade tallrikar. Ordentligt tryck nedåt på toppen av plantan Plate att &quot;knäcka&quot; plattorna. Sedan försiktigt skala Root Plate och plantan Plate APkonst. </li><li> Låt vattnet i Root plattorna tina i rumstemperatur. Upptining kan påskyndas genom inkubering av Root plattorna i en termisk modul som vid 25 ° C. </li></ol> 5. Förvara Groddplanta tavla vid låg temperatur i mörkret Efter vävnad skörd, kan plantan plattorna förvaras i mörker vid låg temperatur som kommer att upprätthålla lönsamheten för plantor medan genotyp analys genomförs. Plantorna kan lagras vid dessa temperaturer i flera veckor utan att påverka lönsamheten. <ol><li> Efter vävnad skörd, täta nedre delen av plantan plattan med tejp. </li><li> Placera en klar plast lock på toppen av plantan Plate och säkra med Micropore tejp. </li><li> Stack flera Seedling Plates ihop och linda in i aluminiumfolie. </li><li> För Arabidopsis plantor, placera plattorna vid 4 ° C. För tomat plantor, placera plattorna vid 12 ° C. När genotypning är klar, SEedlings kan tas bort från denna låg temperatur inkubationstid och transplanteras till mark som beskrivs nedan. </li></ol> 6. DNA-extraktion DNA lämpliga för PCR-reaktioner lätt kan utvinnas från de prover roten vävnad. Avkastningen av det totala DNA återhämtat sig från Arabidopsis prover roten vävnad är ca. 400 ng i genomsnitt 2. <ol><li> Se till att vattnet i Root Plattor helt har tinat innan du utför proceduren DNA-extraktion. Inspektera plattorna för att avgöra om några brunnar har betydligt mindre vatten än genomsnittet. Hand pipett destillerat vatten i brunnar som kräver extra vatten. </li><li> Använd MicroFill maskinen för att lägga till 25 mikroliter av en Tris-EDTA-lösning (500 mM Tris, pH 8, 50 mM EDTA, pH8) till varje brunn på Root plattorna. </li><li> Täta brunnar i Root Plattor med termisk tätning folie och en svetsning maskin. </li><li> Placera den förslutna roten plattorna på GenoGrinder maskinen medförseglade änden av plattorna nedåt. Denna platta orientering ger optimal pärla rörelse och förhindrar att pärlorna fastnar i brunnarna. Skaka plattorna i GenoGrinder i 3 ½ minuter vid 1350 slag per minut. </li><li> Överför plattorna till en centrifug med mikroplattor transportörer och snurra plattorna under 10 minuter vid 3500 rpm vid 4 ° C till pellets de pulveriseras roten vävnad. </li><li> Den resulterande utspädda extraktet innehåller arvsmassans DNA som direkt kan användas i PCR-reaktioner. Typiskt en kommer att lägga 2 mikroliter av denna DNA-extrakt till en PCR-reaktion. </li><li> För lagring av DNA-prover, försegla mikroplattan med självhäftande packning tejp och placera vid minus 20 ° C. DNA-prover kan lagras i flera månader utan uppenbar minskning av kvaliteten. </li></ol> 7. Överför småplantor med Önskad genotyp Soil När genotyp analysen är klar kan plantor med önskade genotyp överförs från plantanPlattor till jord. <ol><li> Ta bort plantan Plattor från kall förvaring och förbereda grytor med vattenmättad jord blandning. </li><li> För att ta bort en enskild planta från plantan Plate, använd en tång som gör att man kan greppa agar kontakten utan att krossa plantan. Ta agar kontakten med pincett och försiktigt skjut agar kontakten ur plantan tavla var försiktig så du inte skadar plantan. Alternativt kan tryckluft användas för att försiktigt skjuta agar kontakten och plantor ur brunnen. Applicera ett tryck på det lilla hålet i botten av brunnen tills kontakten lossnar på lab bänk. </li><li> Förbered ett litet hål i jorden storleken på agar kontakten. Placera agar plugin i marken och packa fuktig jord runt agar kontakten för att säkra plantor i jorden. Försök inte att ta bort någon av de agar från hela plantan. </li><li> Placera transplanterade plantor i en tillväxtfas rum under normala odlingsbetingelser. Täck grytan med ett plastlock förförsta två dagarna efter transplantationen. Därefter tar du bort locket och fortsätter att odla växter med hjälp av vanliga förhållanden. </li></ol> 8. Representativa resultat: Ett exempel på Arabidopsis plantor vuxit med Ice-cap-systemet visas i Figur 4A. Dessa plantor hade varit i Ice-Cap fontän i två veckor när bilden togs och var redo för mjukpapper skörd. Rot vävnad från samma planta visas i figur 4B. Den totala mängden DNA från ett prov av Arabidopsis rot vävnad är vanligtvis i storleksordningen 100 ng till 700 ng 2. Denna avkastning Beräkningen är baserad på användning av endast en del av den råa rot extrakt. Eftersom endast ca. 10% av den råa rotextrakt vanligtvis används för DNA-extraktion, är det möjligt att få betydligt mer arvsmassans DNA för nedströms analys med att behålla mer av den råa utdraget. Det totala beloppet av arvsmassans DNA som erhållits med Ice-Cap förfarandet är tillräcklig för att utföra hundratals PCR-reaktioner 2. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig1.jpg" /> Figur 1: Flödesschema av Ice-Cap process. A) plantor tavla som innehåller media agar tillväxt som plantor gro. Rötter penetrera agar och växer ner mot botten av plattan. Hål i botten av brunnarna i plattan är förseglat med självhäftande film. B) plantan tavla är staplade på en Root tavla som innehåller vatten och en metallkula. Rötter ur hålen i botten av brunnarna för plantan Plate och växa in i brunnarna i Root Plate. C) träspett är införas mellan Seedling Plate och roten tavla dagen före staplade Ice Cap tallrikar placeras i ett termoblock i torr is / etanol bad. D) När vattnet i Root tavla har frusit fast, är plantan tavla skalade bort från roten Plate, vilket ger en Root tavla med 96 vävnadsproveroch en planta tavla med 96 livskraftiga plantor. Den träspett underlätta separation av de två plattorna under detta steg. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig2.jpg" /> Figur 2: Fotografier av en planta Plate och en Root Plate. A) en planta tavla och en Root tavla ses separat. B) en planta tavla ovanpå en Root Plate. Den stålkulor används för DNA-extraktion kan ses i brunnarna i Root Plate. Resårband används för att säkra de två plattor tillsammans. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig3.jpg" /> Figur 3: Ice-Cap Fountain. The Ice-Cap Fountain används för att hålla en konstant vattennivå på den exakta höjden på toppen av brunnarna i Root plattorna. Denna kontinuerliga bevattningssystem ser till att vattnet i brunnarna i roten plattorna inte blir utarmat på grund av avdunstning eller transpiration. A) En hemmagjord racksom stöder cookie blad som staplas Ice-Cap Plates sitta. B) En närbild av en av de 1 &quot;nötter som ger ett medel för att finjustera nivån på cookie blad, så att en enhetlig vattendjup uppnås över ytan av fontänen. C) Denna bild visar alla delar som behövs för att bygga hemmagjorda rack för en Is-Cap Trevi. D) monteras Ice-Cap Trevi. En dränkbar pump fontän ständigt flyttar vatten från nedre reservoaren till cookie blad, som vilar på toppen av hemmagjorda racket. En fjäderbelastad klämma används för att fästa slangen till kanten av cookie blad. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig4.jpg" /> Figur 4: Arabidopsis plantor vuxit med Ice-Cap process. A) uppifrån ser ner i två brunnar på en planta Plate. Varje brunn innehåller en Arabidopsis plantor. B) Sidovy av två brunnar av ett root-Plate. Rötter kan ses vridarunt insidan av brunnarna. Plantorna i den här bilden hade varit i Ice-Cap Fountain för ca. två veckor och är i tillväxtfas där vävnad skörd normalt skulle utföras.

<ol>
	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

The Ice-Cap metoden som presenteras här ger en vetenskapsman för att samla in vävnadsprover från hundratals, eller tusentals, i enskilda anläggningar på en enda dag och effektivt utvinna genomisk DNA från dessa prover för användning i genotypning reaktioner. Genom att ge en enskild forskare möjlighet att genotyp tusentals plantor under en kort tid har Ice-Cap metoden kan underlätta en rad genetiska experiment som annars inte skulle vara praktiskt att utföra. Flera exempel finns nedan. <ol><li> Genetisk kartläggning. Fine-scale genetisk kartläggning kan påskyndas om forskaren kan identifiera rekombination händelser inom ett visst intervall längs kromosom 3. Om detta intervall innebär en mycket kort genetiskt avstånd, då rekombination händelserna kommer att vara relativt ovanliga i segregerande kartlägga befolkningen. Av denna anledning kan det vara nödvändigt att screena tusentals enskilda anläggningar för att hitta önskad igencombinant individer. Denna process kan bli kraftigt påskyndas genom användning av Ice-Cap. Även i en tid präglad av genomet hela re-sekvensering är det fortfarande nödvändigt att direkt visa att en viss mutation är direkt ansvarig för en fenotyp av intresse. I dessa fall kommer det att bli nödvändigt att segregera mutationen av intresse från andra nära kopplade mutationer för att bevisa en kandidat mutation är faktiskt orsakar. I dessa situationer skulle Ice-Cap ger en effektiv metod för att bryta kopplingen mellan ett par tätt kopplade mutationer. </li><li> Multi-mutanter. Det har blivit vanligt för forskare att studera Arabidopsis att kombinera muterade alleler från flera olika loci i en enda individ för att övervinna funktionella redundans 4-6. Som ett exempel anser ett fall där man vill kombinera muterade alleler från fyra olika loci i en enda planta genom genetisk korsning. För detta projekt kommer det att bli nödvändigt att ta fram enn individ som är heterozygot i dessa fyra loci som en del av korsningen systemet. När detta fyrdubbla-heterozygot sätter frö, är fyrdubbel homozygota förväntas finnas i en takt av en av 256 i den resulterande populationen av avkomma. Screening för denna sällsynta enskilda med traditionella metoder skulle vara ganska arbetskrävande. Som jämförelse skulle med Ice-Cap för detta projekt ge forskare med en effektiv strategi för att identifiera de sällsynta fyrdubbla homozygota i en enda generation. </li><li> iTILLING. Vårt laboratorium beskrev nyligen en ny metod för att screening av förekomsten av inducerade mutationer i gener av intresse i Arabidopsis 7. Denna metod är en variant av en etablerad teknik som kallas Tilling som används för att hitta mutationer i beställde populationer av individer behandlats med en kemisk mutagen 8-10. Vi kallar vår metod iTILLING eftersom det är en individualiserad version av Tilling som gör att en individual vetenskapsman för att åstadkomma något som traditionellt har krävt en stor forskargrupp att slutföra. Is-Cap utgör en integrerad del av iTILLING metod 7, som beskrivs nedan. </li></ol> Tanken bakom iTILLING är att producera en kortlivad mutant befolkning, vilket står i kontrast till den hållbara muterade populationer som skapats för traditionell markberedning projekt. För iTILLING är frön från en bulk M2 befolkning sått i 50 till 100 block Ice Cap, och DNA extraheras med Ice-Cap-metoden. Arabidopsis plantor sedan placeras vid 4 ° C medan mutation screening utförs med hjälp av Ice-Cap DNA preps. Tomat plantor lagras vid 12 ° C.. När plantor bär önskade mutationer har identifierats, de återhämtat sig från Ice-Cap plattor och överföras till jord. iTILLING är inte avsedd att ge en långvarig mutant befolkningen för en hel forskarsamhället till skärmen. Istället ger iTILLING en strategi genom vilkenen vetenskapsman kan skärmen en anpassad mutant befolkningen för mutationer i ett fåtal gener snabbt, effektivt och till en relativt låg kostnad. Vi har funnit Is-Cap vara en effektiv metod för växande och genotypning Arabidopsis, tomat och ris. Vi förväntar oss att andra arter av växter även bör vara möjligt att Ice-Cap. En begränsning om de olika arter som kan rymmas i Ice-Cap är storleken på frön. Endast växter med frön liten nog att passa in i brunnar i en 96-brunnar kommer att vara kompatibla med Ice-Cap i sin nuvarande konfiguration.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Maskin för att skaka Root Plattor för DNA-extraktion </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0384 </td><td> Manuell svetsning maskin som används för att Root Plates före vävnad störningar </td></tr><tr><td> Centrifug utrustas med svängande mikroplatta bärare </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Varje centrifug med svängande mikroplattan bärare skulle vara lämpliga </td></tr><tr><td> MicroFill mikroplattor Dispenser </td><td> Biotek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Automatiserad flytande dispenser för fyllning mikroplattor </td></tr><tr><td> Bialetti varumärke17x11 cm Kommersiella Stora cookie blad </td><td> Mål Department Store </td><td> www.bialetti.com </td><td> Denna specifika cookie blad har den idealiska djup för Ice-Cap </td></tr><tr><td> Custom Made Metal Rack </td><td> Järnaffär </td><td></td><td> Se text för fullständig beskrivning </td></tr><tr><td> 33 Liter förvaringslåda av plast </td><td> Mål Department Store </td><td> Sterilite Märke </td><td> För Ice-Cap Fountain. Plast förvaringsbox stor nog att hålla 17x11 cm cookie blad </td></tr><tr><td> 30 liter per timme Fountain Pump </td><td> Sunterra </td><td> 104.506 </td><td> Små dränkbara fontän pump som finns i butiker trädgård utbudet </td></tr><tr><td> Slang för fontän pump </td><td> Varje lab distributionsföretag </td><td></td><td> Slang kompatibel med fontän pump </td></tr><tr><td> Plast Clamp </td><td> Järnaffär </td><td></td><td> Clamp för att hålla slangen cookiesplåt </td></tr><tr><td> Klart plastlock från Falcon mikrotiterplattan plan botten 96-väl polystyren plattor </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351.172 </td><td> Klar plast lock som täcker Ice-Cap Seedling Plates </td></tr><tr><td> 3M Micropore kirurgtejp </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch diameter rostfria stålkulor </td><td> Hartford Technologies, Rocky Hill, CT </td><td> 034-006-1K </td><td> Används för att störa roten vävnad efter skörd </td></tr><tr><td> 3 tums Elastiska hårsnoddar </td><td> Lokala mataffär </td><td></td><td> Används för att säkra Root tavla till Seedling Plate </td></tr><tr><td> 4 mm diameter träspett </td><td> Lokala mataffär </td><td></td><td> Dessa spett används vanligtvis för att förbereda Kabobs </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc varumärke, 1-ml filter plattor utan frit </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278.012 </td><td> 96-väl Seedling Plattor med hål i botten. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR-tavla </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-väl Root Plates </td></tr><tr><td> Agar - cellodling testade </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic syra (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige och Skoog (MS) basala salt blandning </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Easy Peel svetsning folie </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0745 </td><td> Svetsning film för tätning av Root Plattorna före vävnad störningar </td></tr><tr><td> Duck Brand Extra Wide Förpackning tejp, 3,00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Artikel no. 21242139 </td><td> Tejpför tätning mikroplattor innehåller DNA-extrakt för lagring </td></tr><tr><td> Tätning Roller </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Handhållen rullande verktyg för att trycka självhäftande tätningsband på mikroplattor </td></tr><tr><td> 96-bra metal termisk blocket </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36.400-66 </td><td> Används för att frysa Root Plattor för vävnad skörd </td></tr><tr><td> Whatman Filtrerpapper </td><td> Whatman International </td><td> 1002 090 </td><td> Används för utanpåliggande sterilisera frön </td></tr><tr><td> Disponibel pasteurpipett </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;disponibel pasteurpipett används för överföring av frön att Seedling tavla </td></tr><tr><td> Pyrex ugnsform (20 cm x 30 cm) </td><td> Mål Department Store </td><td></td><td> Används för att konstruera en torris / etanol bad. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

Det blir vanligt att anläggningen forskare att utveckla projekt som kräver genotypning av ett stort antal växter. Det första steget i en genotypning projektet är att samla ett vävnadsprov från varje enskild anläggning. Den traditionella metoden att denna uppgift är att smaka växter en-på-ett-tiden. Om man vill genotyp hundratals eller tusentals individer, dock med hjälp av denna strategi resulterar i en betydande flaskhals i genotypning gång. The Ice-Cap metod som vi beskriver här ger en hög genomströmning lösning på denna utmaning genom att låta en forskare att samla in vävnad från flera tusen plantor på en enda dag 1,2. Denna nivå av genomströmning är möjligt tack vare det faktum att vävnaden är skördade från växter 96-i-ett-tiden, snarare än en-på-ett-tiden. The Ice-Cap-metoden ger en integrerad plattform för att utföra plantor tillväxt, vävnad skörd, och DNA-extraktion. Grunden för Ice-Cap är tillväxten av seedlings i en staplad par plattor med 96 brunnar. Brunnarna i övre plattan innehåller pluggar media agar tillväxt på vilka enskilda plantor gro. Rötterna växer ner genom agar media, avslutar den övre plattan genom ett hål, och övergå i en lägre skylt som innehåller vatten. Att skörda vävnad för DNA-extraktion, vattnet i den nedre plattan innehåller roten vävnad snabbt fryses medan plantorna i den övre plattan förvaras i rumstemperatur. Den övre plattan är sedan skalade bort från undre plattan, vilket ger en tallrik med 96 prover rot vävnad frysta i isen och en tallrik med 96 livskraftiga plantor. Tekniken heter &quot;Ice-Cap&quot; eftersom den använder isen för att fånga roten vävnad. Den 96-brunnar som innehåller plantor kan sedan insvept i folie och överföras till låg temperatur. Denna process avbryter ytterligare tillväxt av plantor, men påverkar inte deras livskraft. När genotyp analys har slutförts kan plantor med önskade genotyp överföras från 96-bra psent att marken för vidare förökning. Vi har visat nyttan av Ice-Cap-metoden med hjälp av Arabidopsis thaliana, tomat, och plantor ris. Vi förväntar oss att metoden även bör gälla för andra arter av växter med frön liten nog att passa in i brunnarna i 96-hålsplattor.

Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap-metoden gör att man kan odla växter i 96-brunnar och icke-förstörande skörd rot vävnad från varje planta. DNA extraherat från denna rot vävnad kan användas för genotypning reaktioner. Vi har funnit att Ice-Cap fungerar bra för<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Tomat och ris plantor.

Ice-Cap: En metod för odling Arabidopsis Och tomatplantor i 96-brunnar för high-throughput Genotypning

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: En enkel metod för noggrann Genotypning

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

En hög genomströmning Metod för Zebrafish Spermier Frysförvaring och In Vitro Befruktning

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

En snabb hög kapacitet metod för kartläggning Ribonucleoproteins (RNPs) om mänskliga pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på 96 Tja mikrotiterplattor

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Mätning rumsliga och tids Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaler i Arabidopsis växter

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Mätning Oxidativ stress Resistans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I 96-brunnars mikrotiterplattor

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Hög genomströmning crispr Vektorkonstruktion och karakterisering av DNA Ändringar av Generation tomat håriga Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Ljus Sheet fluorescensmikroskopi av växtrötter som växer på ytan av en gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...