Name: fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability
Uploaded: 2011-08-05T15:00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability at JoVE.com

De auteurs danken Dan Bess van Sigma-Aldrich voor het presenteren van de video. We danken ook Don Branch, Evgenii Cherny, Scott Chesla, Elizabeth Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov, en Eleanor Williams voor hun resultaten en bijdragen aan het ontwerp, de synthese van FSL constructies en het bepalen van biologische activiteit.

Het volgende protocol beschrijft de algemene procedure voor het invoegen van FSL constructen (figuur 1) in biologische membranen. Voor de eenvoud van het protocol zal alleen verwijzen naar cellen (kodecytes), die zich op een 100% concentratie. Echter, de term cellen is uitwisselbaar met virionen (kodevirions) of organismen of cellulaire structuren en hun concentratie in verdunningsmiddel is niet belangrijk, mits het is altijd consistent tussen de tests, controles en experimenten. Met de rode bloedcellen van de hematocriet is normaal gesproken 80%, maar met virionen, embryo&#39;s en andere cellen is meestal minder dan 1%. De methode is zeer robuust en zal produceren gewijzigd membranen bij gebruik door een van haar variaties, maar verfijning vereist zal zijn om te optimaliseren en standaardiseren van de mate van verandering die nodig is voor specifieke toepassingen. 1. Voorbereiding van de FSL constructen <ol><li> Ter voorbereiding van de bouw van FSL voorraad oplossing eerst herstellen van de droge FSL product (tabel 1) door de toevoeging van 1,0 ml oplosmiddel (of zoals gespecificeerd in het product insert) om het product flacon. Kort met ultrasone trillingen (30 seconden). Dit zal een 1mg/ml oplossing, die kan worden in hoeveelheden verdeeld in 100 ul steriele containers en bewaard bij 2-8 ° C gedurende een week, of bevroren voor maximaal 3 maanden. </li><li> Ter voorbereiding op het werken FSL bouwen oplossingen voor het inbrengen, maar voorafgaand aan het gebruik kort met ultrasone trillingen (30 seconden) de voorraad oplossing voor elk micellen homogeniseren. Verdun het FSL bouwen in buffer (bij voorkeur niet met lipiden of sterk hydrofoob materiaal) om de concentratie of vereiste over een bereik indien gewenst. </li></ol> Opmerkingen: <ol><li> FSL bouwt zal meestal in te voegen in cellen in lipide bevattende media, maar is algemeen vereist dat zo veel als een 50x hogere concentraties FSL werken dan wanneer in PBS of andere lipiden vrije media. </li><li> Het werkbereik verdunningen zal afhangen van de toepassing, de detectiemethode gevoeligheid, de aard van de FSL bouwen, en de mate van wijziging nodig is. Typisch het bereik van de verwatering zal worden tussen de 10-500 ug van FSL per ml oplosmiddel voor koolhydraten FSL bouwt en 100 tot 100 ug / ml voor andere FSL constructies zoals fluoroforen en biotine. </li><li> Als voorbereiding inbrengen oplosmiddelen met meerdere FSL bouwen, gewoon bij elkaar voegt de constructen in hetzelfde verdunningsmiddel op hun normale arbeidstijd concentratie. Als een construct is bij veel hogere concentratie dan de ander, kunnen sommige aanpassingen (toename) van concentratie die nodig is voor de mindere te bouwen. Als alternatief bouwt mogen na elkaar worden toegevoegd, bij voorkeur met de hoogste concentratie eerste construct, gevolgd door de mindere. </li><li> FSL bouwen concentraties hoger dan 1000 ug / ml kan invoeren grote hoeveelheden lipide in een celmembraan, en kan de vorm van de cel te wijzigen of maken het meer vatbaar voor lysis. </li><li> FSL construeren werkende oplossingen moeten worden bewaard bij 2-8 ° C en binnen een paar dagen. </li><li> FSL constructen kunnen worden verdund in water, maar een geringere stabiliteit en moeten worden gebruikt binnen een paar uur. Als de bijsluiter geeft water als oplosmiddel de reconstitutie van het product in de flacon bevat ook zouten (zoals gespecificeerd in de bijsluiter). </li></ol> 2. Invoeging van FSL Construct (s) in de membranen <ol><li> Was eerst de cellen voor FSL wijziging vrij van ongebonden lipiden door middel van centrifugeren en het gebruik van PBS of lipide gratis mobiele media als wasoplossing. </li><li> Verpak de cellen of op te schorten in 100 pi verdunningsmiddel. </li><li> Tegelijkertijd bereiden controles die idealiter zowel ongemodificeerd cellen (geïncubeerd met PBS in plaats van FSL-oplossing) en / of cellen gemodificeerd met een goedaardige, maar verwante FSL bouwen. </li><li> Voeg 100 ul van een geschikte verdunning van FSL-oplossing (met 1 of meer FSL constructies) om de cellen en gedurende 1-2 uur bij 37 ° C. incubeer Een soortgelijk resultaat kan worden verkregen door het 6 uur incubatie bij 25 ° C of &#39;s nachts (18 uur) bij 4 ° C - mengen is aan te bevelen om de paar uur of zware celsuspensies worden gebruikt. </li><li> Wash (optioneel) tweemaal met PBS of media aan op een willekeurig FSL construeert te verwijderen en een geschikte suspensie te bereiden. </li></ol> Opmerkingen: <ol><li> Het oplosmiddel wordt gebruikt om de cellen te schorten kan worden celcultuurmedia, PBS, cel storage-oplossingen, etc, maar liefst zonder lipiden (bijv. foetaal kalf serum) of reinigingsmiddelen (bijv. TWEEN). </li><li> Verschillende volumes (dan 100 pi) ratio&#39;s (dan 1:1 cellen / FSL oplossing) of incubatie omstandigheden van tijd en temperatuur kan worden gebruikt, mits het dezelfde verhouding, concentratie en het volume worden gebruikt om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. </li></ol> 3. Hanteren en Visualisatie <ol><li> Zodra het FSL wijziging is afgerond de kodecytes kan worden opgeslagen bij 4-8 ° C in lipide vrije media of gebruikt. </li><li> Kodecytes en kodevirions over het algemeen gedragen zich hetzelfde als niet-gemodificeerde cellen / virionen en kan worden Handled en bekeken onder normale testen van systemen (microscopie, serologie, flowcytometrie, etc). Ze hebben meestal geen speciale eisen, behalve voor het vermijden van oplosmiddelen / reinigingsmiddelen / lipiden die elueren de lipide constructies van membranen. </li></ol> Opmerkingen: <ol><li> Constructen blijft in het membraan van inactieve cellen, zoals rode cellen, indien opgeslagen in lipide vrije media voor het leven van de cel. In cellen met actieve membranen de constructies zullen worden geïnternaliseerd en gemetaboliseerd, met een snelheid afhankelijk van de celmembraan activiteit. </li><li> Dode cellen zal bevatten meestal een hoog niveau van FSL constructies, dit kan gebruikt worden om niet-levensvatbaar cellen van levensvatbare cellen te scheiden. </li><li> Als kodecytes worden opgeslagen (of gebruikt in vivo) in lipiden bevattende media / omgevingen, zoals serum / plasma het construct zal langzaam uit het membraan elueren over een periode van uren of dagen, afhankelijk van temperatuur en lipiden concentraties / composities. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: <ol><li> De volgende representatieve resultaten hangen af ​​van het construct gebruikt (tabel 1), zijn ingebracht concentratie en de relatieve sensitiviteit en specificiteit van de detectie-installatie (s). In het algemeen alle FSL constructies zullen invoegen in cellen na 1 uur, maar de optimale omstandigheden zal moeten worden vastgesteld voor elke situatie. </li><li> FSL constructen kunnen worden gebruikt om de buitenkant van een verscheidenheid van levende cellen 3-9,11,14 label. In de voorbeelden in figuur 2 embryo&#39;s in de verschillende stadia werden gebruikt (omdat ze een kwetsbaar cel), maar ook andere cellen (figuur 3) of envelop virionen (figuur 4) kan ook worden geëtiketteerd. FSL-fluoresceïne maakt het mogelijk om direct etikettering van oppervlakken (figuren 2-4), terwijl de FSL-biotine en andere FSL bouwt kan het gebruik van een secundaire detectiesysteem (meestal avidine / antilichamen / lectines) nodig hebben om hun aanwezigheid (Figuren 5) tonen . </li><li> Bloedgroep markers van menselijke of dierlijke specificiteit kan worden bevestigd aan cellen, met inbegrip van rode cellen 4-9 (Figuur 6). Naarmate de hoeveelheid FSL construeren op een kodecyte is controleerbaar en reproduceerbaar 4-6, kan kodecytes voor antilichamen kwantificatie worden gemaakt (tabel 2 en figuur 6). De werkelijke bron van de cellen is niet belangrijk, ze kunnen alle soorten, of zelfs van dezelfde oorsprong als de bron van antilichaam, waarbij zorgen over de enige onverenigbaar antigeen wordt ingevoerd bij het ​​FSL 7,8 (Figuur 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tabel 2" /> Tabel 2. Representatieve serologische reacties van drie verschillende FSL-A (tri) rode cellen kodecytes getest op verdunningen van monoklonale anti-A. De 50 pM oplossing van FSL-A (tri) bij geïncubeerd met een gelijk volume van de groep O rode bloedcellen geproduceerd sterke A antigen positieve cellen, die kunnen worden gedetecteerd door een 1:512 verdunning van monoklonale anti-A. De 5 - en 10-voudig lagere FSL-A (tri) oplossingen geproduceerd kodecytes met minder bloedgroep A antigen expressie. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="FSL bouwen overzicht" /> Figuur 1. FSL bouwen overzicht. Als een bloem FSL constructies bestaat uit drie belangrijke componenten. De functionele hoofd (F) in het geval van de FSL construct kan een verscheidenheid van verschillende biologisch functionele groepen, een spacer (S) ontworpen om afstand van F veroorzaken uit de buurt van het membraan, water dispergeerbaarheid te verbeteren en niet-reactief met serum te worden, terwijl de diacyl lipiden kan de te bouwen om spontaan op te nemen in oppervlakken. (I) FSL-Gb3 met een bloedgroep Gb 3 (of P k) trisaccharide epitoop Galα4Galβ4Glcβ. (II) FSL-A (tri) met een bloedgroep A trisaccharide epitoop GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-fluoresceïne. (IV) FSL-biotine met een biotine F-groep. De functionele groep van de structuren in I-III zijn geconjugeerd met een geactiveerde adipaat derivaat van dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), terwijl de spacer van de structuur IV is carboxymethylglycine-adipaat gebaseerd. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="FSL-fluoresceïne gelabeld muis embryo&#39;s" /> Figuur 2. FSL-fluoresceïne gelabeld muis embryo&#39;s. Alle afbeeldingen zijn van levende embryo&#39;s die waren gelabeld als hun zona pellucida (ZP) was intact (dwz de FSL bouwen doorgegeven via de ZP om de embryo binnen label). Foto&#39;s I-IV zijn van ZP-vrij embryo&#39;s vrijgelaten uit hun ZP met zuur tyrodes na labeling met FSL-fluoresceïne. Identieke kleuren gebeurt ongeacht of embryo&#39;s werden FSL bewerkt met ZP intacte of ZP gratis. Embryo&#39;s worden direct voorzien van FSL-fluoresceïne, door de 2 uur 37 ° C-methode in serum vrij van media voor celkweek, gewassen en vervolgens bekeken onder fluorescentie microscopie. (I) ZP gratis twee-cel muis embryo, ook met klassieke intense polaire lichaam vlekken. (II-III) ZP gratis vier-cel en acht cel muizen embryo&#39;s, zowel met schimmige kleuring van de cellen die outside de microscoop vlak van focus. (IV) ZP gratis 16 cellen van muizen embryo. (V) ZP intact murine blastocyst embryo&#39;s (D4-D5), waar zowel het embryo en de zona zijn gelabeld. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-fluoresceïne en zebravis" /> Figuur 3. FSL-fluoresceïne en zebravis 14. (I) Microangiography op een 52 HPF (uren na de bevruchting) zebravis larven direct geïnjecteerd in de circulatie met FSL-fluoresceïne. De zebravis vasculatuur is gekleurd. (II) FSL-fluoresceïne heterogene zebravis nierweefsel cellen (ZK kodecytes) werden gecreëerd ex vivo dan micro-geïnjecteerd in de circulatie van een 52 hpf ontvanger zebravis. In vivo observaties van de ZK kodecytes werden twee uur na de injectie door beeldvorming van de vasculatuur onder fluorescentie met time-lapse microscopie. Afgebeeld is een enkele video-frame met grote langzaam bewegende of onbeweeglijke cellen (aangegeven met oranje pijlen) en de snel bewegende cellen (onscherpe foto&#39;s door beweging - aangegeven met groene pijlen). Labeling zorgt voor real-time in vivo observatie van het gedrag en de biologische verdeling van de ZK kodecytes. (III) orale opname van FSL-fluoresceïne bereikt door het onder te dompelen zebravis embryo&#39;s in FSL-fluoresceïne bevattende media voor maximaal 5 dagen. Wassen werd bereikt door de overdracht van embryo&#39;s in media die geen FSL constructen (minstens 6 uur is vereist, maar kan worden voor meerdere dagen). (IIIa) Bright veld microscopie van de FSL-fluoresceïne behandeld zebravis die overeenkomen met de naastgelegen fluorescentie beeld (IIIb). De fluorescentie is bij voorkeur gelegen in het darmkanaal. Geen kleuring werd waargenomen in onbehandelde controle embryo&#39;s (IVa en IVb). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="FSL-fluoresceïne etikettering van virionen" /> Figuur 4. FSL-fluoresceïne etikettering van virionen 10 VSV en H1N1. (I) vesiculaire stomatitis virus (VSV) werd direct gemerkt met 10 ug / ml FSL-fluoresceïne gedurende 2 uur bij 37 ° C, gevolgd door de vaststelling van met 4% paraformaldehyde en dan flowcytometrie. Geen zuivering van het VSV kodevirion na FSL labeling nodig was. (II) Flowcytometrie van varkens testiculaire cellen die geïnfecteerd met het humaan A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) kodevirions geëtiketteerd met FSL-fluoresceïne. Niet-geïnfecteerde cellen worden gezien als de zwarte lijn, terwijl fusie van de H1N1 kodevirion met de ST-cellen resulteert in een fluorescerende cel (rode lijn). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="FSL-biotine gelabelde cellen" /> Figuur 5. FSL-biotine gelabelde cellen en de daaropvolgende visualisatie via gelabeld avidine 7,8. Alle cellen werden voor het eerst gelabeld met FSL-biotine gedurende 1 uur bij 37 ° C, gewassen vervolgens reageren met fluorofoor gelabeld avidine, gewassen en natte gemonteerd voor fluorescentie microscopie. (I) Compiled confocale beeld van een muizen-embryo blastocyst. (II) Centraal confocale deel van het embryo van de voorgaande afbeelding. (III) Live beweeglijke menselijke spermatozoa - vervagen optreedt als gevolg van hun beweging. (IV) Vast (4% paraformaldehyde post-inserter) menselijke spermatozoa. (V) Human erytrocyten. (VI) Vast (4% paraformaldehyde pre-insertion) RL95 endometrium menselijke carcinoom. (VII) niet vastgelegde RL95 endometrium carcinoom menselijke cellijn. (VIII) Biotine RBC kodecytes waargenomen in een bloedmonster genomen 2 uur intraveneuze infusie van kodecytes post met (VIII), wat neerkomt op een veld bekeken onder lichtmicroscopie while (VIIIb) is het hetzelfde veld bekeken onder de fluorescentie, het identificeren van de twee kodecytes aanwezig zijn in het veld -of-view. De berekening van de verhouding van kodecytes aan ongelabelde cellen kan gebruik worden als een indicator van overleven. (IX) Live menselijk endometrium biotine kodecytes gevisualiseerd door te binden aan avidinylated kralen. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-Koolhydraten de bloedgroep markers toe te voegen voor serologische profilering" /> Figuur 6. FSL-Carbohydrate de bloedgroep markers toe te voegen voor serologische profilering. (I) Menselijke rode bloedcellen Galili kodecytes zijn gemaakt met een set concentratie van FSL-Galili (500 ug / ml) en getest op verdunningen van humaan serum. Menselijke rode bloedcellen van nature niet voorkomen met de xenoantigen Galili antigeen. Dergelijke kodecytes kunnen gebruikt worden om kwantitatieve niveaus van antilichamen in het serum. In dit voorbeeld is de donor was vastbesloten om een ​​anti-Galili titer van 1:32 hebben. (II) Door het creëren van kodecytes met afnemende niveaus van FSL (&quot;antigeen titers&quot;), een optimale antigen niveau om de opsporing van antilichamen kan worden bepaald (in dit voorbeeld Le a). Cellen kunnen worden gemaakt om alleen op te geven een positief resultaat wanneer het antilichaam niveau overschrijdt een specifieke titer. Het niveau van FSL antigeen nodig is om een ​​positief resultaat geven afhankelijk van de kwaliteit en het niveau van antilichaam worden ontdekt. Voor koolhydraten antigenen, zal een FSL oplossing van 100 ug / ml meestal resulteren in een sterk positieve reactie. (III) Human groep O rode cellen werden aangepast om een ​​bepaald niveau van A mier hebbenigen (gestandaardiseerde A kodecytes), en gebruikt om nauwkeurig en reproduceerbaar anti-A kwantificeren in humaan serum. In dit voorbeeld is de anti-A-titer in de groep O-serum getest is 1:32 en de kodecytes werden bereid uit de eigen donor rode bloedcellen. (IV) bloedgroep A-en B-antigenen tegelijk ingebracht in een enkele groep O rode celmonster worden gebruikt om een zwakke B zwak kodecytes te creëren. Deze kodecytes kunnen worden gebruikt voor ABO kwaliteitscontrole. Dit resultaat toont de analyse van een speciaal samengesteld Een zwakke B zwak kodecyte getest tegen anti-A en anti-B-reagentia en geeft de verwachte zwakke reacties.

<ol>
	<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Strable, E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+of+viruses+and+virus-like+particles.">Chemical modification of viruses and virus-like particles.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 327, 1-21 (2009).</li><li>Henry, S., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+synthetic+peptidolipids,+glycolipids+and+other+lipid-linked+structures+to+create+designer+red+cells.">The development of synthetic peptidolipids, glycolipids and other lipid-linked structures to create designer red cells.</a> Transfusion. 48, 194A-194A (2008).</li><li>Frame, T., Carroll, T., Korchagina, E., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+glycolipid+modification+of+red+blood+cell+membranes.">Synthetic glycolipid modification of red blood cell membranes.</a> Transfusion. 47, 876-882 (2007).</li><li>Hult, A. K., Frame, T., Henry, S., Olsson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+evaluation+of+red+blood+cells+transformed+with+variable+amounts+of+synthetic+A+and+B+glycolipids.">Flow cytometry evaluation of red blood cells transformed with variable amounts of synthetic A and B glycolipids.</a> Vox Sang. 95, 180-180 (2008).</li><li>Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+red+blood+cells+for+laboratory+quality+control+use.">Modification of red blood cells for laboratory quality control use.</a> Curr. Opin. Hematol. 16, 467-472 (2009).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neutralization+of+anti-A+and+successful+transfusion+of+A+antigen+incompatible+red+cells+in+an+animal+model.">In vivo neutralization of anti-A and successful transfusion of A antigen incompatible red cells in an animal model.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+transfusion+reactions+and+predicting+in+vivo+cell+survival+with+kodecytes.">Modeling transfusion reactions and predicting in vivo cell survival with kodecytes.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Heathcote, D., Carroll, T., Wang, J. J., Flower, R., Rodionov, I., Tuzikov, A., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antibody+screening+cells,+MUT+Mur+kodecytes,+created+by+attaching+peptides+onto+erythrocytes.">Novel antibody screening cells, MUT+Mur kodecytes, created by attaching peptides onto erythrocytes.</a> Transfusion. 50, 635-641 (2010).</li><li>Hadac, E. M., Federspiel, M. J., Chernyy, E., Tuzikovb, A., Korchagina, E., Bovin, N. V., Russell, S. J., Henry, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+and+radiolabeled+Function-Spacer-Lipid+constructs+allow+for+simple+in+vitro+and+in+vivo+bioimaging+of+enveloped+virions.">Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions.</a> J Virol Meth. 10, (2011).</li><li>Blake, D., Lan, A., Love, D., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-kodecytes+-+fluorescent+function-spacer-lipid+(FSL)+modified+cells+for+in+vitro+and+in+vivo+analyses.">Fluorophore-kodecytes - fluorescent function-spacer-lipid (FSL) modified cells for in vitro and in vivo analyses.</a> FEBS J.. 277, 199-199 (2010).</li><li>Harrison, A. L., Olsson, M. L., Brad Jones, R., Ramkumar, S., Sakac, D., Binnington, B., Henry, S., Lingwood, C. A., Branch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+globotriaosylceramide+analogue+inhibits+HIV-1+infection+in+vitro+by+two+mechanisms.">A synthetic globotriaosylceramide analogue inhibits HIV-1 infection in vitro by two mechanisms.</a> Glycobiology. 27, 515-524 (2010).</li><li>Barr, K., Diegel, O., Parker, S., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-Spacer-Lipid+(FSL)+constructs+enable+inkjet+printing+of+blood+group+antigens.">Function-Spacer-Lipid (FSL) constructs enable inkjet printing of blood group antigens.</a> FEBS J. 277, 235-235 (2010).</li><li>Lan, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling inflammatory bowel disease [dissertation]. , (1988).</li></ol>

Deborah A. Blank en Stephen M. Henry zijn werknemers en aandeelhouders van Kode Biotech Limited het octrooi eigenaar van Kode technologie. Dan Bess is een medewerker van Sigma-Aldrich, die heeft gesponsord voor de productie van deze video-artikel.

Het wijzigen van cellen en virionen met FSL constructies is een zeer eenvoudige en robuuste techniek 3-11. Te beschrijven en te onderscheiden FSL bouwen gemodificeerde cellen en virionen van niet gemodificeerde cellen, worden ze genoemd kodecytes en kodevirions respectievelijk 6-10, maar alleen wanneer de geïntroduceerde functionele groep kan worden aangetoond om aanwezig te zijn op hun membraan. Wanneer kodecytes zijn gemaakt met verschillende concentraties van FSL constructies, kunnen ze worden aangeduid met de concentratie van de FSL construct-oplossing gebruikt om ze te maken, bijvoorbeeld 15 ug / ml A kodecytes, of als meer dan een FSL wordt dan gebruik gemaakt van een gecombineerd term, bijvoorbeeld A + biotine kodecytes 7,8. Bij de verschillende cellen moeten worden vergeleken, met inbegrip van het celtype in de beschrijving wordt aanbevolen, bijvoorbeeld rode bloedcellen biotine kodecytes of endometrium biotine kodecytes 7,8. Hoewel het proces van inbrengen is zeer robuust en het inbrengen (zij het met verschillende tarieven) zal plaatsvinden over een groot temperatuurbereik 4 tot 37 ° C en binnen minuten tot uren, tot reproduceerbare inbrengen strikte controle van contact tijd, temperatuur, FSL de concentraties ( inclusief verdunningsmiddel formulering), en in mindere mate cel concentratie vereist. Tot op heden zijn alle FSL constructen kunnen worden gebruikt om cellen te wijzigen door dezelfde techniek 4-11, maar het wordt verwacht dat bepaalde voorwaarden gunstiger zijn voor work-flow en / of op de optimale afhandeling eisen van de cellen / virions te worden gewijzigd . De exacte FSL concentratie om het gewenste effect te bereiken moet worden bepaald door de gebruiker 4. De resulterende FSL construct gemodificeerde cellen / virionen kan meestal worden gebruikt in dezelfde wijze als een niet-gemodificeerde cellen / virion in biologische of analytische systemen 4-11. Als het FSL bouwt langzaam elueren van gemodificeerd oppervlakken wanneer ze in contact met de lipide-oplossingen 7,8, of worden geconsumeerd door actieve cellen 11, moeten deze problemen worden met betrekking tot het niveau van signaal of activiteit verkregen over periodes van tijd. Kodecytes kan worden vastgesteld (bijv. glutaaraldehyde / formaline) na het inbrengen op voorwaarde dat de fixeermiddel niet lipide-eluting oplosmiddelen bevatten en de functionele groep is compatibel met het fixeermiddel. Als alternatief vaste cellen kunnen worden gewijzigd met FSL constructen. In aanvulling op de wijziging van de cel en virion oppervlakken FSL constructen kunnen ook direct worden toegediend in de circulatie van proefdieren veroorzaken in vivo modificatie van circulerende cellen 7 en 12 om virussen, giftige stoffen, 12 en 7 antilichamen remmen. FLS bouwt zijn ook gebruikt om liposomen versieren en kunnen worden afgedrukt op papier oppervlakken 13, waar ze immobiliseren, en kan vervolgens worden gebruikt in diagnostische assays. De mogelijkheid om eenvoudig te wijzigen levende cellen met een toenemend aanbod van FSL constructies moet een nuttig onderzoek en ontwikkeling hulpmiddel voor de studie van celoppervlak biologie worden.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tabel 1" /> Tabel 1. Commercieel verkrijgbare FSL constructies zoals beschreven in dit document.

fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability

De mogelijkheid om te wijzigen / visualiseren biologische oppervlakken, en vervolgens de studie van de gewijzigde cel / virion in een reeks van in vitro en in vivo omgeving is essentieel voor het verkrijgen van meer inzicht in de functie van specifieke moleculen of het gehele entiteit. Studies van biologische oppervlakte modificatie zijn over het algemeen beperkt tot de genetische manipulatie van het organisme of de covalente koppeling van chemische groepen aan het celoppervlak 1,2. Maar deze traditionele technieken bloot de cel chemische reactanten, of ze zijn aanzienlijke manipulatie om het gewenste resultaat te bereiken, waardoor ze lastig, en ze kunnen ook ongewild invloed hebben op de levensvatbaarheid / functionaliteit van de gewijzigde cel. Een eenvoudige methode om onschuldig te wijzigen het oppervlak van cellen is vereist. Onlangs is een nieuwe technologie, heeft Kode Technology introduceert een reeks van nieuwe constructies bestaande uit drie componenten: een functionele kopgroep (F), een spacer (S) en een lipide staart (L) en staan ​​bekend als functie-Spacer-Lipid of FSL constructs3. De spacer (S) is geselecteerd om een ​​constructie die is dispergeerbaar in water te voorzien, maar toch zal spontaan en stabiel op te nemen in een membraan. FSL construct functionele groepen (F) tot nu toe onder andere een reeks van sacchariden waaronder bloedgroep determinanten met betrekking tot, siaalzuren, hyaluronan polysacchariden, fluoroforen, biotine, radiolabels, en een reeks van peptiden 3-12. FSL constructies zijn gebruikt bij het ​​wijzigen embryo&#39;s, zaadcellen, zebravis, epitheliale / endometriumcellen, rode bloedcellen, en de virionen aan kwaliteitscontroles systemen en diagnostische panelen, te creëren om celadhesie / interactie / scheiding / immobilisatie te wijzigen, en voor in vitro en in vivo beeldvorming van cellen / virionen 3-12. Het proces van de aanpassing van cellen / virionen is generiek en uiterst eenvoudig. De meest gebruikelijke procedure is incubatie van de cellen (in lipiden gratis media) met een oplossing voor het FSL bouwt gedurende 1-2 uur bij 37 ° C 4-10. Tijdens de incubatie de FSL constructies spontaan op te nemen in het membraan, en het proces is voltooid. Wassen is optioneel. Cellen die zijn gemodificeerd door FSL constructies staan ​​bekend als kodecytes 6-9, terwijl de virionen zijn kodevirions 10. FSL bouwt als directe infusies en kodecytes / kodevirions zijn gebruikt in experimentele diermodellen 7,8,10. Alle kodecytes / kodevirions lijken hun normale vitaliteit en functionaliteit te behouden, terwijl het verkrijgen van de nieuwe functie van de F-groep 7,8,10,11. De combinatie van dispersie in biocompatibele media, spontane opname in celmembranen, en schijnbare lage toxiciteit, maakt FSL bouwt waardevolle research tools voor de studie van cellen en virionen.

Watch this Scientific Journal Video about FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability at JoVE.com

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Functie-Spacer-Lipid (FSL) constructies kan de oppervlakte-eigenschappen van levende cellen en virions worden gewijzigd zonder verlies van vitaliteit. De methode vereist slechts een eenvoudige aanraking van een FSL bouwen oplossing met een cel / virion en spontaan en stabiele ondergrond incorporatie optreedt.

FSL Constructen: Een eenvoudige methode voor het wijzigen van Cell / Virion Oppervlakken met een bereik van biologische merkers zonder dat hun levensvatbaarheid

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

Research

JoVE Journal

Biology

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Fabricage van myogene Engineered Tissue constructen

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Een Lectin HPLC-methode voor het selectief-geglycosyleerde Peptiden Enrich van complexe biologische monsters

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualiseren van Single-molecule DNA-replicatie met fluorescentiemicroscopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Synthese en Kalibratie van Phosphorescent nanosondes voor zuurstof Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Een eenvoudig protocol voor het extraheren van hemocyten van Wild Rupsen

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Recombineering homologe recombinatie in Constructen<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...