Name: fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability
Uploaded: 2011-08-05T15:00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability at JoVE.com

Författarna tackar Dan Bess från Sigma-Aldrich för att presentera filmen. Vi vill också tacka Don Branch, Evgenii Cherny, Scott Chesla, Elizabeth Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov, och Eleanor Williams för sina resultat och bidrag till design, syntes av FSL bygger och bestämma biologisk aktivitet.

Följande protokoll beskriver generiska förfarande för införande av FSL konstruktioner (Figur 1) i biologiska membran. För enkelhets protokollet kommer bara referera till celler (kodecytes), är på 100% koncentration. Dock är termen cellerna utbytbar mot virioner (kodevirions) eller organismer eller cellulära strukturer och deras koncentration i spädmedel är inte viktigt, förutsatt att det alltid är konsekvent mellan tester, kontroller och experiment. Med röda blodkroppar i hematokrit är vanligtvis 80%, men med virioner, embryon och andra celler är vanligtvis mindre än 1%. Metoden är mycket robust och kommer att producera modifierad membran när den används av någon av dess varianter, men förfining kommer att krävas för att optimera och standardisera den grad av modifiering som krävs för specifika applikationer. 1. Beredning av FSL Konstruerar <ol><li> För att förbereda FSL konstruera lager lösningen först beredning av torra FSL produkten (tabell 1) genom tillsats av 1,0 ml spädningsvätska (eller vad som anges i produktbladet) till flaskan. Kortfattat Sonikera (30 sekunder). Detta kommer att utarbeta ett 1mg/ml lösning, som kan alikvoteras till 100 mikroliter sterila behållare och lagras vid 2-8 ° C i upp till en vecka, eller frysas i upp till 3 månader. </li><li> För att förbereda arbetar FSL konstruera lösningar för insättning, bara före användning kort Sonikera (30 sekunder) stamlösning för att homogenisera alla miceller. Späd FSL bygger i buffert (helst inte innehåller lipider eller mycket hydrofoba material) och koncentrationen som krävs eller över en rad om så önskas. </li></ol> Anmärkningar: <ol><li> FSL bygger lägger vanligtvis in i celler i lipid som innehåller media men kommer vanligtvis att kräva lika mycket som en 50X högre FSL brukslösningar än om i PBS eller andra lipid fria medier. </li><li> Arbetsområdet spädningar beror på tillämpningen, detektionsmetoden känslighet, typ av FSL konstruera, och graden av förändring som krävs. Typiskt utbud av utspädningen kommer att vara mellan 10-500 mikrogram FSL per ml spädningsvätska för kolhydrater FSL bygger och 100-100 mikrogram / ml för andra FSL konstruktioner såsom fluoroforer och biotin. </li><li> Om att förbereda införandet spädningsvätskor innehållande flera FSL konstruera, helt enkelt lägga till konstruerar tillsammans i samma vätska på sin ordinarie arbetstid koncentration. Om en konstruktion är i mycket högre koncentration än en annan, kan viss justering (ökning) i koncentration krävas för mindre konstruktion. Alternativt konstruktioner kan läggas sekventiellt, helst med den högsta koncentrationen bygga först, följt av de mindre. </li><li> FSL konstruera koncentrationer över 1000 mikrogram / ml får införa stora mängder fett i ett cellmembran, och kan ändra formen på den cell eller göra det mer mottagliga för lys. </li><li> FSL konstruera fungerande lösningar bör förvaras vid 2-8 ° C och användas inom några dagar. </li><li> FSL konstruktioner kan spädas i vatten men kommer att ha minskat stabiliteten och måste användas inom timmar. Om bipacksedeln anger vattnet som upplösningsmedel produkten i flaskan kommer också att innehålla salter (enligt bipacksedeln). </li></ol> 2. Införande av FSL Konstruera (er) i Membranes <ol><li> Tvätta först de celler för FSL ändras utan obundet lipider genom centrifugering och använda PBS eller lipid fria medier cell som tvättlösning. </li><li> Packa celler eller tillfälligt upphäva 100 mikroliter lösningsmedel. </li><li> Samtidigt förbereder kontroller som helst ska vara både oförändrade celler (inkuberas med PBS snarare än FSL lösning) och / eller celler som modifierats med en godartad men relaterade FSL konstruktion. </li><li> Tillsätt 100 mikroliter av en lämplig utspädning av FSL lösning (som innehåller en eller flera FSL konstruktioner) till cellerna och inkubera i 1-2 timmar vid 37 ° C. Ett liknande resultat kan uppnås med 6 timmars inkubation vid 25 ° C eller över natten (18 timmar) vid 4 ° C - blandning rekommenderas vart några timmar om tunga cellsuspensioner används. </li><li> Tvätta (tillval) två gånger med PBS eller media för att ta bort fria FSL konstruerar och förbereda en lämplig fjädring. </li></ol> Anmärkningar: <ol><li> Spädningsvätskan som används för att stoppa cellerna kan cellodling medier, PBS, cell lagringslösningar, etc, men helst utan fett (t ex fetalt kalvserum) eller rengöringsmedel (t.ex. Tween). </li><li> Olika volymer (100 mikroliter) nyckeltal (än 1:01 celler / FSL lösning) eller villkor inkubation av tid och temperatur kan användas förutsatt att samma förhållande, koncentration och volym används för att få reproducerbara resultat. </li></ol> 3. Hantering och visualisering <ol><li> När FSL modifiering processen har slutfört kodecytes kan förvaras vid 4-8 ° C i lipid fria medier eller används. </li><li> Kodecytes och kodevirions beter sig i allmänhet på samma sätt som omodifierade celler / virioner och kan handlED och visas under normala testsystem (mikroskopi, serologi, flödescytometri, etc). De har oftast inga särskilda krav förutom för undvikande av lösningsmedel / rengöringsmedel / lipider som kan eluera lipid konstruerar från membran. </li></ol> Anmärkningar: <ol><li> Konstruerar kommer att finnas kvar i membranet av inaktiva celler, såsom röda blodkroppar, om den förvaras i lipid fria medier för livet av cellen. I celler med aktiva membran i konstruktioner kommer att internaliseras och metaboliseras i en takt beroende av cellmembranet aktivitet. </li><li> Döda celler kommer oftast innehåller höga halter av FSL konstruktioner, vilket kan användas för att separera icke-livsdugliga celler från levande celler. </li><li> Om kodecytes lagras (eller användas in vivo) i lipid som innehåller media / miljöer, såsom serum / plasma bygga långsamt eluera från membranet under en period av timmar eller dagar, beroende på temperatur och lipid koncentrationer / kompositioner. </li></ol> 4. Representativa resultat: <ol><li> Följande representativa resultat beror på vilken konstruktion som används (tabell 1), dess infogas koncentration och relativ sensitivitet och specificitet Detection System (s). I allmänhet alla FSL konstruktioner kommer in i celler efter 1 timme men det optimala förhållanden måste upprättas för varje situation. </li><li> FSL konstruktioner kan användas för att märka utsidan av en mängd levande celler 3-9,11,14. I exemplen visas i Figur 2 embryon i olika stadier har använts (eftersom de är en bräcklig cell), men andra celler (Figur 3) eller insvept virioner (Figur 4) kan också märkas. FSL-Fluorescein möjliggör direkt märkning av ytor (figur 2-4), medan FSL-biotin och andra FSL konstruktioner kan kräva användning av en sekundär detektionssystem (oftast avidin / antikroppar / lektiner) för att visa sin närvaro (figur 5) . </li><li> Blodgrupp markörer för människors eller djurs specificitet kan fästas på celler, inklusive röda blodkroppar 4-9 (Figur 6). Eftersom mängden FSL bygga på en kodecyte är kontrollerbar och reproducerbar 4-6, kan kodecytes för antikroppar kvantifiering göras (tabell 2 och figur 6). Den verkliga källan till celler är inte viktigt, de kan alla arter, eller ens av samma ursprung som källan till antikropp, vilket säkerställer den enda oförenlig antigen som införts av FSL 7,8 (Figur 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tabell 2" /> Tabell 2. Representant serologiska reaktioner av tre olika FSL-A (tri) röda blodkroppar kodecytes testas mot spädningar av monoklonala anti-A. Den 50 mikroM lösning av FSL-A (tri) då inkuberas med en lika stor volym grupp O röda blodkroppar produceras starka A-antigen positiva celler, som kan upptäckas av en 1:512 utspädning av monoklonala anti-A. De 5 - och 10-faldigt lägre FSL-A (tri) lösningar som produceras kodecytes med mindre blodgrupp A-antigen uttryck. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="FSL konstruera översikt" /> Figur 1. FSL konstruera översikt. Som en blomma FSL konstruerar består av tre huvudkomponenter. Den funktionella huvudet (F) i fråga om FSL bygga kan vara en mängd olika biologiskt funktionella grupper, en distans (S) för att få avstånd av F bort från membranet, förbättra vatten dispersibility och vara icke-reaktiva med serum, medan diacyl fett gör att konstruera att spontant införliva ytor. (I) FSL-Gb3 med en blodgrupp Gb 3 (eller P k) trisaccharide epitop Galα4Galβ4Glcβ. (II) FSL-A (tri) med blodgrupp A trisaccharide epitop GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-fluorescein. (IV) FSL-biotin med en enda biotin F fraktionen. Den funktionella gruppen av strukturer i I-III är konjugerade med ett aktiverat adipat derivat av dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) medan spacer av struktur IV är carboxymethylglycine adipat baserade. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="FSL-Fluorescein märkt mus embryon" /> Figur 2. FSL-Fluorescein märkt mus embryon. Alla bilder är levande embryon som var märkta när deras zona pellucida (ZP) var intakt (dvs. FSL konstruera passerade genom ZP att märka embryot inuti). Bilder I-IV är av ZP-fria embryon frigörs från sina ZP med syra tyrodes inlägg märkning med FSL-fluorescein. Identiska färgning sker oavsett om embryon har FSL modifierad med ZP intakt eller ZP gratis. Embryon är direkt märkta med FSL-Fluorescein, med 2 timmar 37 ° C metod i serum fria medier cellodling, tvättade och sedan ses under fluorescensmikroskopi. (I) ZP fritt två-cells murint embryo som också visar klassiska intensiv polära kroppen färgning. (II-III) ZP fritt fyra-cell och åtta celler murina embryon, både visar skugglika färgning av celler som är outsIDE mikroskop plan fokus. (IV) ZP fria 16 cell murina embryo. (V) ZP intakt murina blastocysten embryon (D4-D5) där både embryot och zona är märkta. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-Fluorescein och zebrafisk" /> Figur 3. FSL-Fluorescein och zebrafisk 14. (I) Microangiography på en 52 HPF (timmar efter befruktning) zebrafisk larver direkt sprutas in i cirkulationen med FSL-fluorescein. Den zebrafisk kärlbädden är fläckig. (II) FSL-Fluorescein heterogena Zebrafish njurvävnaden celler (ZK kodecytes) skapades ex vivo sedan mikro-sprutas in i cirkulationen av en 52 HPF mottagare zebrafisk. In vivo-observationer av ZK kodecytes gjordes två timmar efter injektion av avbildning av kärlsystemet i fluorescens med time-lapse mikroskopi. Som visas är en bildruta med stora långsamma eller orörliga celler (indikeras med orange pilar) och snabbrörliga celler (suddiga bilder på grund av rörelse - markerade med gröna pilar). Märkning möjliggör realtid in vivo-observation av beteende och biodistribution i ZK kodecytes. (III) oralt upptag av FSL-Fluorescein uppnås genom att sänka ner zebrafisk embryon i FSL-Fluorescein med media för upp till 5 dagar. Tvätt uppnåddes genom att överföra embryon i medier som inte innehåller FSL konstruktioner (minst 6 timmar krävs men kan vara i flera dagar). (IIIa) Bright området mikroskopi av de behandlade FSL-Fluorescein zebrafisk som motsvarar de intilliggande fluorescens bilden (IIIb). Den fluoresence var företrädesvis belägna i tarmkanalen. Ingen färgning observerades i obehandlad kontroll embryon (IVa och IVb). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="FSL-Fluorescein märkning av virioner" /> Figur 4. FSL-Fluorescein märkning av virioner 10 VSV och H1N1. (I) vesikulär stomatit virus (VSV) var direkt märkt med 10 mikrogram / ml FSL-Fluorescein under 2 h vid 37 ° C, följt av fastsättning med 4% paraformaldehyd och flödescytometri. Ingen rening av VSV kodevirion inlägg FSL märkning krävdes. (II) Flödescytometri av svin testikelceller infekterade med humant A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) kodevirions märkt med FSL-fluorescein. Oinfekterade celler ses som den svarta linjen, medan fusion av H1N1 kodevirion med ST-celler ger en fluorescerande celler (röd linje). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="FSL-biotin märkta celler" /> Figur 5. FSL-biotin märkta celler och efterföljande visualisering via märkt avidin 7,8. Alla celler var först märkta med FSL-biotin för 1 h vid 37 ° C, tvättade sedan reagerade med fluoroforen märkt avidin, tvättade och våt monteras för fluorescensmikroskopi. (I) Sammanställt konfokala bilden av en mus embryo blastocyst. (II) Central konfokala bit av ett embryo från föregående bild. (III) Live rörliga mänskliga spermier - oskärpa uppstår som en konsekvens av deras rörelse. (IV) Fast (4% paraformaldehyd inbladning) mänskliga spermier. (V) erytrocyt. (VI) Fast (4% paraformaldehyd före insättning) RL95 endometrial mänskliga carcinoma. (VII) ofixerade RL95 endometriehyperplasi mänskliga carcinoma cellinje. (VIII) Biotin RBC kodecytes observerats i ett blodprov tas 2 timmar efter intravenös infusion av kodecytes med (VIIIa) som representerar ett fält ses under ljusmikroskop while (VIIIb) är samma område ses under fluorescens, identifiera de två kodecytes på fältet -of-view. Beräkna förhållandet mellan kodecytes att omärkta celler kan användas som en indikator på överlevnad. (IX) levande mänskliga livmoderslemhinnan biotin kodecytes visualiseras genom att binda till avidinylated pärlor. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-Kolhydrater för att lägga till markörer blodgrupp för serologisk profilering" /> Figur 6. FSL kolhydrater för att lägga till markörer blodgrupp för serologiska profilering. (I) Människa röda blodkroppar Galili kodecytes skapades med en uppsättning koncentration av FSL-Galili (500 mikrogram / ml) och testade mot spädningar av humanserum. Mänskliga röda blodkroppar som inte förekommer naturligt med xenoantigen Galili antigen. Sådana kodecytes kan användas för kvantitativa nivåer av antikroppar i serum. I detta exempel donatorn var fast besluten att ha en anti-Galili titer på 1:32. (Ii) genom att skapa kodecytes med sjunkande nivåer av FSL (&quot;antigen titer&quot;), en optimal antigen nivå för att upptäcka antikroppar kan bestämmas (i detta exempel Le ett). Celler kan skapas för att bara ge ett positivt resultat när antikroppsnivån överstiger ett visst titer. Nivån på FSL antigen krävs för att ge ett positivt resultat beror på kvaliteten och nivån av antikroppar upptäcks. För kolhydrater antigen kommer en FSL lösning 100 mikrogram / ml resultera vanligtvis i en stark positiv reaktion. (III) Människa grupp O röda blodkroppar ändrades ha en viss nivå av en myraiGen (standardiserade A kodecytes), och används för att noggrant och reproducerbart kvantifiera anti-A i humanserum. I detta exempel anti-A-titer i gruppen O serum testas är 1:32 och kodecytes var beredda från givare egna röda blodkroppar. (IV) blodgrupp A och B antigen samtidigt in i en enda grupp O red cell prov används för att skapa en svag B svag kodecytes. Dessa kodecytes kan användas för Åbo för kvalitetskontroll. Detta resultat visar analysen av ett specifikt formulerat en svag B svag kodecyte testas mot anti-A och anti-B reagenser och ger förväntat svaga reaktioner.

<ol>
	<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Strable, E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+of+viruses+and+virus-like+particles.">Chemical modification of viruses and virus-like particles.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 327, 1-21 (2009).</li><li>Henry, S., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+synthetic+peptidolipids,+glycolipids+and+other+lipid-linked+structures+to+create+designer+red+cells.">The development of synthetic peptidolipids, glycolipids and other lipid-linked structures to create designer red cells.</a> Transfusion. 48, 194A-194A (2008).</li><li>Frame, T., Carroll, T., Korchagina, E., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+glycolipid+modification+of+red+blood+cell+membranes.">Synthetic glycolipid modification of red blood cell membranes.</a> Transfusion. 47, 876-882 (2007).</li><li>Hult, A. K., Frame, T., Henry, S., Olsson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+evaluation+of+red+blood+cells+transformed+with+variable+amounts+of+synthetic+A+and+B+glycolipids.">Flow cytometry evaluation of red blood cells transformed with variable amounts of synthetic A and B glycolipids.</a> Vox Sang. 95, 180-180 (2008).</li><li>Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+red+blood+cells+for+laboratory+quality+control+use.">Modification of red blood cells for laboratory quality control use.</a> Curr. Opin. Hematol. 16, 467-472 (2009).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neutralization+of+anti-A+and+successful+transfusion+of+A+antigen+incompatible+red+cells+in+an+animal+model.">In vivo neutralization of anti-A and successful transfusion of A antigen incompatible red cells in an animal model.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+transfusion+reactions+and+predicting+in+vivo+cell+survival+with+kodecytes.">Modeling transfusion reactions and predicting in vivo cell survival with kodecytes.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Heathcote, D., Carroll, T., Wang, J. J., Flower, R., Rodionov, I., Tuzikov, A., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antibody+screening+cells,+MUT+Mur+kodecytes,+created+by+attaching+peptides+onto+erythrocytes.">Novel antibody screening cells, MUT+Mur kodecytes, created by attaching peptides onto erythrocytes.</a> Transfusion. 50, 635-641 (2010).</li><li>Hadac, E. M., Federspiel, M. J., Chernyy, E., Tuzikovb, A., Korchagina, E., Bovin, N. V., Russell, S. J., Henry, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+and+radiolabeled+Function-Spacer-Lipid+constructs+allow+for+simple+in+vitro+and+in+vivo+bioimaging+of+enveloped+virions.">Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions.</a> J Virol Meth. 10, (2011).</li><li>Blake, D., Lan, A., Love, D., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-kodecytes+-+fluorescent+function-spacer-lipid+(FSL)+modified+cells+for+in+vitro+and+in+vivo+analyses.">Fluorophore-kodecytes - fluorescent function-spacer-lipid (FSL) modified cells for in vitro and in vivo analyses.</a> FEBS J.. 277, 199-199 (2010).</li><li>Harrison, A. L., Olsson, M. L., Brad Jones, R., Ramkumar, S., Sakac, D., Binnington, B., Henry, S., Lingwood, C. A., Branch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+globotriaosylceramide+analogue+inhibits+HIV-1+infection+in+vitro+by+two+mechanisms.">A synthetic globotriaosylceramide analogue inhibits HIV-1 infection in vitro by two mechanisms.</a> Glycobiology. 27, 515-524 (2010).</li><li>Barr, K., Diegel, O., Parker, S., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-Spacer-Lipid+(FSL)+constructs+enable+inkjet+printing+of+blood+group+antigens.">Function-Spacer-Lipid (FSL) constructs enable inkjet printing of blood group antigens.</a> FEBS J. 277, 235-235 (2010).</li><li>Lan, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling inflammatory bowel disease [dissertation]. , (1988).</li></ol>

Deborah A. Blank och Stephen M. Henry är anställda och aktieägare i Kode Biotech Limited patent på Kode teknik. Dan Bess är anställd i Sigma-Aldrich, som har sponsrat produktionen av denna video-artikeln.

Modifiera celler och virioner med FSL konstruktioner är en mycket enkel och robust teknik 3-11. För att beskriva och särskilja FSL konstruera modifierade celler och virioner från omodifierade celler, de kallas kodecytes och kodevirions respektive 6-10, men bara när de införde funktionell grupp kan visas att närvara på deras membran. När kodecytes görs med olika koncentrationer av FSL konstruktioner, kan de anges som koncentrationen av FSL konstruera lösning som används för att skapa dem, t.ex. 15 mikrogram / ml Ett kodecytes, eller om mer än en FSL används sedan en kombinerad sikt, t.ex. A + biotin kodecytes 7,8. När olika celler ska jämföras, inklusive celltyp i beskrivningen rekommenderas, t.ex. röda blodkroppar biotin kodecytes eller livmoderslemhinnan kodecytes biotin 7,8. Även om processen för insättning är mycket robust och insättning (om än med olika skattesatser) kommer att ske över ett stort temperatur mellan 4 - 37 ° C och inom några minuter till timmar, för att få reproducerbara insättning strikt kontroll av kontakttid, temperatur, FSL koncentration ( inklusive spädningsvätska formulering) och i mindre utsträckning cellkoncentrationen behövs. Hittills kan alla FSL konstruktioner användas för att modifiera celler med samma teknik 4-11, men det väntas att vissa villkor kommer att bli mer gynnsamma för arbets-flöde och / eller den optimala krav hantering av celler / virioner ändras . Den exakta FSL koncentration för att uppnå önskad effekt måste fastställas av användaren 4. Den resulterande FSL konstruera modifierade celler / virioner kan oftast användas på samma sätt som en omodifierade celler / virionens i biologiska eller analytiska system 4-11. Som FSL bygger sakta eluera från modifierade ytor i kontakt med lipid lösningar 7,8, eller konsumeras av aktiva celler 11, måste dessa frågor beaktas med hänsyn till nivån på signalen eller aktivitet som erhålls under tidsperioder. Kodecytes kan vara fast (t.ex. glutaraldehyd / formalin) efter insättning förutsatt att fixativ inte innehåller lipid-eluerar lösningsmedel och den funktionella gruppen är kompatibel med fixativ. Alternativt fasta celler kan modifieras med FSL konstruktioner. Förutom ändringen av cellen och virionens ytor FSL konstruktioner kan också infunderas direkt in i cirkulationen av försöksdjur som orsakar in vivo modifiering av cirkulerande celler 7 och hämma virus 12, toxiner, 12 och antikroppar 7. FLS konstruktioner har också använts för att dekorera liposomer och kan skrivas ut på papper ytor 13, där de orörlig, och kan sedan användas i diagnostiska analyser. Möjligheten att enkelt ändra levande celler med ett ökande utbud av FSL konstruktioner skulle visa sig vara ett användbart forskning och utveckling verktyg för studier av cellens yta biologi.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tabell 1" /> Tabell 1. Kommersiellt tillgängliga FSL konstruktioner som beskrivs i detta dokument.

fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability

Möjligheten att ändra / visualisera biologiska ytor, och sedan studera den modifierade cellen / virus i en rad in vitro och in vivo miljöer är viktigt att få ytterligare insikt i funktionen av specifika molekyler eller hela enheten. Studier av biologiska ytmodifiering är i allmänhet begränsade till genteknik i organismen eller kovalent bindning av kemiska beståndsdelarna till cellytan 1,2. Men dessa traditionella tekniker utsätter cellen till kemiska reaktanter, eller de kräver betydande manipulation för att uppnå önskat resultat, vilket gör dem ohanterliga, och de kan också oavsiktligt påverka lönsamheten / funktionaliteten i den modifierade cellen. En enkel metod för att ofarligt modifiera ytan av celler krävs. Nyligen kom en ny teknik har Kode Technology infört en rad nya konstruktioner som består av tre delar: en funktionell huvudet grupp (F), en distans (S) och ett lipid svans (L) och är kända som Function-Spacer-Lipid eller FSL constructs3. Distansen (S) har valts för att ge en konstruktion som är dispergerbara i vatten, men kommer spontant och stabilt införliva ett membran. FSL konstruera funktionella beståndsdelarna (F) hittills omfatta en rad sackarider inklusive relaterade gruppen blod bestämningsfaktorer, sialic syror, hyaluronan polysackarider, fluoroforer, biotin, Radioaktivt, och en rad peptider 3-12. FSL konstruktioner har använts i modifiera embryon, spermier, zebrafisk, epitelceller / endometrial celler, röda blodkroppar och virioner skapa kvalitetskontroller system och diagnostiska paneler, ändra celladhesion / interaktion / separation / immobilisering, och för in vitro och in vivo-avbildning av celler / virioner 3-12. Processen att ändra celler / virioner är generisk och mycket enkel. Det vanligaste förfarandet är inkubering av celler (i lipid fria medier) med en lösning för FSL bygger i 1-2 timmar vid 37 ° C 4-10. Under inkubering FSL bygger spontant införliva i membranet, och processen är klar. Tvätt är valfritt. Celler som modifierats genom FSL konstruktioner kallas kodecytes 6-9, medan virioner är kodevirions 10. FSL konstruktioner som direkta infusioner och kodecytes / kodevirions har använts i experimentella djurmodeller 7,8,10. Alla kodecytes / kodevirions verkar behålla sin normala vitalitet och funktionalitet samtidigt som du får den nya funktionen i F fraktionen 7,8,10,11. Kombinationen av dispersibility i biokompatibla media, spontana införlivande i cellmembranen och uppenbara låg toxicitet, gör FSL bygger värdefull forskning verktyg för studier av celler och virus.

Watch this Scientific Journal Video about FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability at JoVE.com

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Funktion-Spacer-Lipid (FSL) konstruerar låta ytegenskaper levande celler och virioner ändras utan förlust av vitalitet. Metoden kräver endast enkel kontakt med en FSL konstruera lösning med en cell / virionens och spontan och stabil yta införlivandet inträffar.

FSL Konstruerar: en enkel metod för att ändra Cell / Virion Ytor med en rad biologiska markörer utan att påverka deras livskraft

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

Research

JoVE Journal

Biology

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: En enkel metod för noggrann Genotypning

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Tillämpning av en C. elegans Dopamin Neuron Degeneration-analys för validering av potentiella Parkinsons sjukdomsgener

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Tillverkning av Myogenic vävnadstekniska Konstruerar

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

En lektin HPLC-metod för att berika selektivt glykosylerat peptider från komplexa biologiska prover

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualisera enda molekyl DNA-replikering med fluorescensmikroskopi

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Syntes och kalibrering av Phosphorescent Nanoprobes för Oxygen Imaging i biologiska system

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Lineage Märkning av Zebrafish Celler med laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

En enkel metod för Imaging Arabidopsis Blad Använda Perfluorodecalin som en infiltrativ Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Ett enkelt protokoll för att extrahera hemocyter från Wild Larver

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Recombineering homolog rekombination Konstruktionerna i<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...