Name: tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy
Uploaded: 2011-09-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een onderzoeksbeurs van Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). L. Liu is een ontvanger van CIHR New Investigator Award (MSH-95374).

1. Voorbereiding van de chemoattractant in agarosegel <ol><li> Pipetteer 10 ml van 2 x PBS in een 50-mL conische buis, en opwarmen van de buis door het in een bekerglas met warm water. </li><li> Pipetteer 10 ml gedestilleerd water en 0,4 g agarose poeder in een andere 50-mL conische buis toe te voegen (met de dop iets los) en verwarm het mengsel tot net koken in een magnetron (voor ~ 1 min in een 700 watt magnetron) . </li><li> Voeg de verwarmde 2 × PBS om agarose oplossing buis, zwenk de gemengde oplossing en houd h...

<ol>
	<li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment:+organ-specific+mechanisms+of+action.">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li><li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+leukocyte+recruitment:+an+in+vivo+perspective.">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li><li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites:+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade.">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li><li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation.">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Intravitale microscopie is een belangrijk gereedschap voor het openbaren van de cellulaire en moleculaire mechanismen van leukocyten werving tijdens de ontsteking. Kwantitatieve visualisatie voor de bepaling van leukocyten-endotheliale cel interacties in microvasculatuur van doorschijnend weefsels zoals cremaster spier-en mesenterium blijft de gouden standaard voor de toepassing van de techniek 1,5. De conventionele helderveld microscopie intravitale heeft vele unieke technische eigenschappen en de werving me...

Tabel: Materialen, specifieke reagentia en apparatuur <table border="1"><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Polyethyleen buizen, PE10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427401 </td><td> ID 0,28 mm × OD 0.61mm </td></tr><tr><td> Oost-Indische inkt </td><td> Speedball Art </td><td> Super Black </td><td> 100% carbon black pigment-no kleurstoffen </td></tr><tr><td> Brandijzer </td><td> Aaron Medische </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Bayer HealthCare, Bayer Inc </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamine hydrochloride </td><td> Bioniche Animal Health Canada, Inc </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> Muizen recombinant MIP-2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharmaceuticals, Inc </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapuur </td></tr><tr><td> Heparine </td><td> Sigma </td><td> H-3.393 </td><td></td></tr><tr><td> Rechtop microscoop </td><td> Olympus </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> 3CCD kleuren video camera </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD-videorecorder </td><td> LG Electronics Inc </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> TV monitor </td><td> LG Electronics Inc </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Water circulator </td><td> Thermo Scientific </td><td> Haake DC10 </td><td></td></tr><tr><td> Slangenpomp </td><td> Gilson; Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster spier board </td><td> Universiteit van Saskatchewan </td><td></td><td> Huisgemaakte </td></tr></table>

tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy

De aanwerving van circulerende leukocyten uit het bloed stroom naar het ontstoken weefsel is een cruciaal en complex proces van ontsteking 1,2. In de postcapillaire venulen van ontstoken weefsel, leukocyten in eerste instantie ketting en rol op het luminale oppervlak van venular muur. Rolling leukocyten arrestatie op endotheel en ondergaan stevige adhesie in reactie op chemokine of andere chemoattractants op het venular oppervlak. Veel aanhanger leukocyten verplaatsen van de eerste plaats van hechting aan de junctionele extravasatie site in endotheel, een proces genaamd intraluminale kruipen 3. Na kruipen, leukocyten bewegen over endotheel (transmigratie) en in extravasculaire weefsel migreren naar de bron van chemoattractant (chemotaxis) 4. Intravitale microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van leukocyten-endotheliale cel interacties in vivo en onthullende cellulaire en moleculaire mechanismen van leukocyten werving 2,5. In dit rapport, bieden wij een uitgebreide beschrijving van het gebruik van helderveld microscopie intravitale te visualiseren en de gedetailleerde processen van neutrofielen rekrutering in de muis cremaster spier te bepalen in reactie op de gradiënt van een neutrofiel chemoattractant. Aan neutrofielen werving en selectie, een klein stukje van de agarose gel (~ 1 mm-3 formaat) met neutrofiel chemoaantrekkende MIP-2 (CXCL2, een CXC chemokine) of WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, een synthetisch analoog te induceren van bacteriële peptide) wordt geplaatst op het spierweefsel grenzend aan de waargenomen postcapillaire venule. Met de tijd-vervallen video-fotografie en computer software ImageJ, neutrofielen intraluminale kruipen op endotheel, neutrofiel transendotheliale migratie en de migratie en chemotaxis in het weefsel worden gevisualiseerd en bijgehouden. Dit protocol maakt een betrouwbare en kwantitatieve analyse van een groot aantal neutrofielen werving parameters, zoals intraluminale kruipen snelheid, transmigratie tijd, onthechting tijd, migratie snelheid, chemotaxis snelheid en chemotaxis index in weefsel. We laten zien dat het gebruik van dit protocol, deze neutrofielen werving parameters kunnen stabiel worden bepaald en de single cell motoriek handig bijgehouden in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy at JoVE.com

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Intravitale Microscopie van de lies lymfkliertest

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...