Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende den tekniske bistand fra C. Zambataro under optagelserne af denne protokol. Vi takker for støtten fra Glenn Institut for Medicinsk Forskning (SM), The Hillblom fundament, og National Institutes of Health i en Nathan Shock center Award (P30AG025708) og PO1AG025901. JMF blev støttet af T32AG000266 tildelt den Buck Institute for Research on Aging.

<ol>
	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Gratis adgang og produktion af dette af denne artikel er sponsoreret Sigma-Aldrich.</p

Denne metode har mulighed for at generere cardiomyocytter for en række funktionelle og genekspression studier. Undersøgelsen af ​​enkelte celler er et spirende område i genekspression analyse. Fordelen ved at undersøge transkriptionel niveauer på samme niveau som den enkelt celle er, at det giver mulighed for undersøgelse af en ren cellepopulation, hvilket ikke er muligt fra hele vævspræparater. Derudover enkelt celle analyse giver mulighed for undersøgelse af stokastiske variation af mRNA niveauer i enkelte celler til at definere cellepopulationer, der tidligere blev anset for at være homogent 8,9. Ud over at identificere gener, som er potentielt stokastiske i deres genekspression 10,11,12, også den metode, der giver mulighed for identifikation af sjældne cellepopulationer defineret ved deres genekspression profiler. Selv om denne fremgangsmåde giver en række spændende potentielle anvendelser i genekspression analyse, der er whoe forbehold og overvejelser i brugen af ​​enkelte celler. Den primære begrænsning for enkelt celle analyse, er indsamling af nok celler i forsøget på at opnå statistisk signifikans med hensyn til metriske af interesse, for eksempel varians. I de tilfælde, hvor antallet af celler isoleret fra vævet af interesse er ikke en begrænsning, kan man undersøge flere hundrede celler per gruppe, ved hjælp af metoder som næste generation sekventering, eller nanofluidic arrays. Men i nogle tilfælde kan der være vanskeligheder med at skaffe tilstrækkeligt celler fra væv af interesse. Dette kan til dels være forårsaget af idiosynkratiske tidskrævende procedurer for indsamling af de målrettede celletype. Dog kan omhyggelig planlægning og forberedelse før de går med single celleudtagningsmetoden stadig mulighed for streng enkelt celle analyse med begrænset teknisk fejl. Ved behandlingen af ​​de resultater, det skal tages i betragtning, at selv om denne procedure til at isolere celler har været anvendt i talrige studies (herunder mikroskopi, elektrofysiologi, osv.), kan den isolation, selv potentielt effekt genekspression. Som med enhver metode, der manipulerer biologiske prøver, bør resultaterne af dine resultater omhyggeligt valideres for at sikre den enkelt celle udtryk er repræsentativ for vævet sig selv og ikke tekniske bias. Metoder såsom in situ hybridisering kan vise sig nyttigt at verificere disse resultater i intakt væv. Endelig er det afgørende at sikre, at de genererede data undersøges grundigt for kvalitetskontrol. De data, vist i figur 8 viser, at qPCR assays kan være meget robuste i deres særegenhed, som f.eks assay # 13 (A13) eller har en høj grad af variabilitet, som kan føre til tekniske varians som assay # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrodruesyre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobasisk </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protease, Type XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, type I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x DNA Suspension buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) </td><td> Teknova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium pentobarbital </td><td> Henry Schein Vet. Supply * </td><td> Kontakt leverandøren for bestilling </td><td> * Skal anskaffes via en dyrlæge eller lab dyr professionel </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Rxn Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> Hævet III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA primermix </td><td> IDT </td><td> Brugerdefineret </td><td></td></tr><tr><td> Nuklease Gratis vand </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick PCR rensning kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Spektrofotometer </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA-7500 kit </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> Et farvemærkning kit </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus Musculus 12x135k vifte </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Komplet Hele transkriptom Amplification Kit (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Mens en lang række studier har undersøgt genekspression skifter fra homogenater af hjerte væv, dette forhindrer at studere den iboende stokastiske variation mellem celler i et væv. Isolering af rene cardiomyocyte befolkninger gennem en collagenase perfusion af mus hjerter letter generation af enkelt celle microarrays for hele transkriptom genekspression, eller qPCR af specifikke mål ved hjælp af nanofluidic arrays. Vi beskriver her en procedure for at undersøge enkelt celle genekspression profiler af cardiomyocytter isoleret fra hjertet. Dette paradigme giver mulighed for evaluering af målinger af interesse, som ikke er afhængig af den gennemsnitlige (for eksempel variansen mellem celler i et væv), hvilket ikke er muligt ved brug af konventionelle hele væv arbejdsgange til evaluering af genekspression (Figur 1). Vi har opnået solid forstærkning af enkelt celle transkriptomet giver mikrogram dobbelt strandede cDNA, der letter brugen af ​​microarrays om jegndividual celler. I den procedure, vi beskrive brugen af ​​NimbleGen arrays, som blev udvalgt for deres brugervenlighed og evne til at tilpasse deres design. Alternativt kan en reverse transkriptase - specifikke mål forstærkning (RT-STA) reaktion, giver mulighed for qPCR af hundredvis af mål nanofluidic PCR. Ved hjælp af en af ​​disse metoder, er det muligt at undersøge variation i udtryk mellem celler, samt undersøge udtryk profiler af sjældne celletyper inde fra en væv. Samlet set enkelt celle genekspression tilgang giver mulighed for generering af data, der potentielt kan identificere idiosynkratiske udtryk profiler, der er typisk i gennemsnit, når undersøgelsen udtryk for millioner af celler fra typiske homogenater genereret fra hele væv.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enkelt celle udtryk profilering giver den detaljerede genekspression analyse af de enkelte celler. Vi beskriver metoder til isolering af cardiomyocytter, og forberede den resulterende lysates for enten hele transkriptom microarray eller qPCR af specifikke mål.

Single Cell transkriptionel Profilering af Voksen Mouse cardiomyocytter

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering og dyrkning af Neonatal Mouse cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering og Fysiologisk Analyse af Mouse cardiomyocytter

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolering og dyrkning af Voksen Mouse kardiomyocytter for cellesignalering og<em&gt; In vitro</em&gt; Hjertehypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisteret mikrodissektion (LAM) som værktøj for transskriptionsprofilering af enkelte celle Typer

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolation, Kultur og transduktion af Voksen Mouse cardiomyocytter

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-indre celle masse injektion af stamceller fra embryoner fører til højere kimærisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Droplet stregkodesystem-baserede enkelt celle Transcriptomics af voksne pattedyr væv

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Celle type-specifik genekspression profilering i muse leveren

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolation, transfektion og langsigtet kultur af voksne mus og rat kardiomyocytter

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...