Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

De auteurs willen graag de technische bijstand van de C. Zambataro te erkennen tijdens de opnames van dit protocol. Wij dankbaar erkennen de steun van de Glenn Stichting voor Medisch Onderzoek (SM), De Hillblom stichting, en de National Institutes of Health voor een Nathan Shock Center award (P30AG025708) en PO1AG025901. JMF werd ondersteund door T32AG000266 toegekend aan het Buck Instituut voor Onderzoek on Aging.

<ol>
	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Gratis toegang en productie van dit van dit artikel is gesponsord Sigma-Aldrich.</p

Deze methode heeft de mogelijkheid om cardiomyocyten voor een aantal functionele en genexpressie studies te genereren. Het onderzoek van enkele cellen is een snel groeiende gebied in genexpressie analyse. Het voordeel van het onderzoek transcriptionele niveau op het niveau van de enkele cel is dat het onderzoek van een zuivere celpopulatie, wat niet mogelijk is van hele weefselpreparaten mogelijk maakt. Bovendien, single cell analyse maakt voor het onderzoek van stochastische variatie van mRNA niveaus in individuele cellen te celpopulaties die voorheen gedacht werd dat ze homogeen 8,9 definiëren. In aanvulling op het identificeren van genen die mogelijk in hun stochastische genexpressie 10,11,12, de methode maakt het ook mogelijk voor de identificatie van zeldzame celpopulaties gedefinieerd door hun genexpressie profielen. Hoewel deze methode biedt een aantal interessante mogelijke toepassingen in de analyse van genexpressie, zijn er some bedenkingen en overwegingen bij het gebruik van enkele cellen. De belangrijkste beperking aan single cell analyse, is de verzameling van voldoende cellen in het experiment om statistische significantie te bereiken met betrekking tot de metriek van belang, bijvoorbeeld variantie. In gevallen waarin het aantal cellen geïsoleerd uit het weefsel van belang is geen beperking, kan men nagaan honderden cellen per groep, met behulp van benaderingen, zoals next-generation sequencing, of nanofluidic arrays. Echter, in sommige gevallen, kan er moeilijk bij het verkrijgen van voldoende cellen uit het weefsel van belang. Dit kan voor een deel veroorzaakt worden door eigenzinnige tijdrovende procedures voor de verzameling van de beoogde celtype. Kunnen echter een zorgvuldige planning en voorbereiding voordat u verdergaat met enkele cel collectie nog steeds zorgen voor strenge single cell analyse met een beperkte technische fout. Bij het onderzoek van de resultaten moet worden aangenomen, dat, hoewel deze procedure voor het isoleren van cellen is gebruikt in tal van Studies (waaronder microscopie, elektrofysiologie, enz.), kan de isolatie zelf mogelijk effect genexpressie. Zoals bij elke methode waarin de biologische monsters manipuleert, moeten de resultaten van uw bevindingen zorgvuldig worden gevalideerd om ervoor te zorgen de enkele cel expressie representatief is voor het weefsel zelf en niet van technische aard bias. Methoden, zoals in situ hybridisatie kan nuttig zijn om deze resultaten te verifiëren in de intact weefsel. Ten slotte is het essentieel om ervoor te zorgen dat de geproduceerde gegevens zorgvuldig wordt gecontroleerd op kwaliteit te controleren. De gegevens in figuur 8 laat zien dat qPCR assays kunnen zeer robuust zijn in hun specificiteit, zoals de test # 13 (A13) of hebben een hoge mate van variabiliteit die kan leiden tot technische variantie zoals de test # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrodruivenzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobasisch </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protease, Type XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Type I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpentobarbital </td><td> Henry Schein Vet. Supply * </td><td> Contact op met de leverancier voor het bestellen van </td><td> * Moet worden verkregen door middel van een dierenarts of een proefdier professionele </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Rxn Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primer Mix </td><td> IDT </td><td> Gewoonte </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease Gratis water </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR zuivering kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Spectrofotometer </td><td>NanoDrop </td><td> 2000C </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA-7500 kit </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> Een kleur Labeling kit </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k reeks </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex compleet geheel Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Terwijl talrijke studies hebben onderzocht genexpressie verandert van homogenaten van hartweefsel, dit voorkomt dat het bestuderen van de inherente stochastische variatie tussen cellen in een weefsel. Isolatie van pure cardiomyocyte de bevolking door middel van een collagenase perfusie van de muis harten vergemakkelijkt de generatie van de cel-microarrays voor hele transcriptoom genexpressie, of qPCR van specifieke doelen met behulp van nanofluidic arrays. We beschrijven hier een procedure om enkele cel genexpressie profielen van cardiomyocyten geïsoleerd uit het hart te onderzoeken. Dit paradigma kan voor de evaluatie van de statistieken van belang die niet afhankelijk zijn van het gemiddelde (bijvoorbeeld variantie tussen de cellen binnen een weefsel), wat niet mogelijk is wanneer met behulp van conventionele hele weefsel workflows voor de evaluatie van genexpressie (figuur 1). We hebben bereikt robuuste versterking van de interne cel transcriptoom waardoor microgram dubbelstrengs cDNA dat het gebruik van microarrays op i vergemakkelijktNDIVIDUELE cellen. In de procedure beschrijven we het gebruik van NimbleGen arrays die werden geselecteerd voor hun gebruiksgemak en de mogelijkheid om hun ontwerp aan te passen. U kunt ook een reverse-transcriptase - specifieke doelamplificatie (RT-STA) reactie, zorgt voor qPCR van honderden doelstellingen door nanofluidic PCR. Met behulp van een van deze benaderingen, is het mogelijk te onderzoeken of het variabiliteit van expressie tussen de cellen, evenals onderzoeken expressie profielen van zeldzame celtypen vanuit een tissue. Algemeen, de enkele cel genexpressie aanpak zorgt voor het genereren van gegevens die mogelijk kunnen identificeren eigenzinnige expressie profielen die typisch zijn gemiddeld bij het onderzoek van de expressie van miljoenen cellen van de typische homogenaten gegenereerd op basis van hele weefsels.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-inner Cell Mass injectie van embryonale stamcellen tot hogere Chimerism tarieven leidt

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...