Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר סיוע טכני של ג Zambataro במהלך הסרטה של ​​פרוטוקול זה. אנו בתודה להכיר את התמיכה של קרן גלן למחקר רפואי (SM), הקרן Hillblom, ואת מכוני הבריאות הלאומיים של מרכז פרס הלם נתן (P30AG025708) ו PO1AG025901. JMF נתמכה על ידי T32AG000266 הוענק למכון באק לחקר הזדקנות.

<ol>
	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; גישה חופשית וייצור של זה של מאמר זה היא בחסות חברת Sigma-Aldrich.</p

שיטה זו יש את האפשרות ליצור cardiomyocytes במשך מספר פונקציונלי, כמו גם ביטוי במחקרים הגן. בדיקה של תאים בודדים הוא אזור המתפתחת בניתוח ביטוי גנים. היתרון של בחינת רמות תעתיק ברמה של תא יחיד הוא שהיא מאפשרת בדיקה של האוכלוסייה תא טהור, דבר שאינו אפשרי מן ההכנות הרקמה כולה. בנוסף, ניתוח תא בודד מאפשרת בחינה של הסטיות האקראיות של רמות ה-mRNA בתאים בודדים להגדיר אוכלוסיות תאים אשר נחשבו בעבר להיות 8,9 הומוגנית. בנוסף לזיהוי גנים אשר סטוכסטיים פוטנציאל בביטוי הגנים שלהם 10,11,12, השיטה מאפשרת גם זיהוי של אוכלוסיות תאים נדירות שהוגדר על ידי ביטוי הגנים שלהם בפרופילים. אמנם שיטה זו מספקת מספר שימושים פוטנציאליים מרגש בניתוח ביטוי גנים, יש סוםדואר אזהרות ושיקולים השימוש של תאים בודדים. המגבלה העיקרית לניתוח תא יחיד, הוא אוסף של תאים מספיק בניסוי כדי להשיג מובהקות סטטיסטית לגבי מדד של עניין, על השונות למשל. במקרים בהם את המספרים של תאים מבודדים מן הרקמה של עניין היא לא מגבלה, ניתן לבחון מאות תאים לכל קבוצה, תוך שימוש בגישות כגון רצף של הדור הבא, או מערכים nanofluidic. עם זאת, במקרים מסוימים, ייתכן שיש קושי בהשגת מספיק תאים מרקמות של עניין. זה יכול להיגרם בין השאר על ידי נהלים זמן ייחודי אינטנסיבית לאיסוף לסוג תא המטרה. עם זאת, תכנון קפדני הכנה לפני שתמשיך עם אוסף תא בודד עדיין עשויה לאפשר ניתוח קפדני תא בודד עם שגיאה טכנית מוגבלת. כאשר בוחנים את תוצאות אותו יש לקחת בחשבון, כי אף על הליך זה עבור תאים בידוד נעשה שימוש studie רביםs (כולל מיקרוסקופיה, electrophysiology וכו &#39;), את הבידוד עצמו עלול השפעה ביטוי גנים. כמו כל שיטה אשר מתפעל דגימות ביולוגיות, התוצאות של הממצאים שלך צריך להיות תוקף בקפידה כדי להבטיח את הביטוי תא בודד הוא נציג של הרקמה עצמה הטיה לא טכנית. שיטות כמו הכלאה באתרו עשוי להיות שימושי כדי לאמת את התוצאות הללו ברקמות ללא פגע. לבסוף, חשוב להבטיח כי הנתונים המופקים נבדקים בקפידה על בקרת איכות. הנתונים שמוצג באיור 8 ממחישה כי מבחני qPCR עשוי להיות חזקים מאוד ספציפיות, כגון assay # 13 (A13) או רמה גבוהה של השתנות אשר יכול להוביל השונות טכניים כגון assay # 34 (A34).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 monobasic </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> דקסטרוז </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> פרוטאז, סוג XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, סוג I </td><td> וורטינגטון </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> השעיה 1x מאגר ה-DNA (10 mM טריס, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital נתרן </td><td> הנרי שיין וטרינר. אספקת * </td><td> צור קשר עם הספק עבור ההזמנה </td><td> * חייב להיות שנרכשו דרך וטרינר או מעבדה בבעלי חיים מקצועיים </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x מערבבים Rxn </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> עילי III RT פלטינום תקי Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA פריימר Mix </td><td> IDT </td><td> מנהג </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease מים חינם </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick PCR ערכת טיהור </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop ספקטרופוטומטר </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer 7500 ערכת ה-DNA </td><td> Agilent </td><td> 7500 ערכת </td><td></td></tr><tr><td> אחת סימון צבע ערכת </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus שריר 12x135k מערך </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A סורק </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex הגברה השלם Whole Transcriptome Kit (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

אמנם מחקרים רבים בחנו את ביטוי הגן משתנה מן homogenates של רקמת לב, זה מונע לומד את הסטיות האקראיות הטמון בין תאים בתוך רקמה. בידוד של אוכלוסיות cardiomyocyte טהור דרך זלוף collagenase של לבבות עכבר מקלה על הדור של microarrays תא בודד עבור כל ביטוי גנים transcriptome, או qPCR של מטרות ספציפיות באמצעות מערכים nanofluidic. אנו מתארים כאן הליך לבחון את אחד הגנים התא ביטוי פרופילים של cardiomyocytes מבודד בלב. פרדיגמה זו מאפשרת הערכה של מדדים של עניין אשר אינם תלויים מתכוון (עבור השונות למשל בין תאים בתוך הרקמה), אשר אינה אפשרית בעת שימוש רגיל workflows רקמות שלמות לצורך הערכה של ביטוי גנים (איור 1). השגנו הגברה חזקה של transcriptome מיקרוגרם אחד של תא מניב cDNA גדילי כפול המאפשרת את השימוש microarrays על individual תאים. בהליך אנו מתארים את השימוש במערכים NimbleGen אשר נבחרו על מנת להקל את השימוש ואת היכולת להתאים אישית את העיצוב שלהם. לחלופין, transcriptase הפוכה - הגברה היעד תגובה ספציפית (RT-STA), מאפשר qPCR של מאות יעדים על ידי nanofluidic PCR. השימוש באחת הגישות הללו, אפשר לבחון את השתנות ביטוי בין תאים, כמו גם בחינת פרופילי הביטוי של סוגי תאים נדירים מתוך נייר. בסך הכל, תא בודד הגן גישה מאפשרת ביטוי עבור הדור של נתונים שעלולים לזהות פרופילים ביטוי ייחודית כי הם בממוצע בדרך כלל כאשר בוחנים את הביטוי של מיליוני תאים homogenates אופייני שנוצר מרקמות כולו.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...