Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
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लेखकों के लिए इस प्रोटोकॉल के फिल्मांकन के दौरान सी. Zambataro की तकनीकी सहायता स्वीकार करना होगा. हम कृतज्ञता एक नाथन शॉक केंद्र पुरस्कार के लिए ग्लेन मेडिकल रिसर्च (एस), Hillblom नींव, और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के लिए फाउंडेशन (P30AG025708) और PO1AG025901 के समर्थन को स्वीकार करते हैं. JMF T32AG000266 उम्र बढ़ने पर अनुसंधान के लिए बक संस्थान के लिए सम्मानित किया गया द्वारा समर्थित किया गया था.

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	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; फ्री और इस लेख के इस के उत्पादन का उपयोग सिग्मा Aldrich प्रायोजित है.</p

इस विधि के लिए कार्यात्मक की एक संख्या के रूप में अच्छी तरह के रूप में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए cardiomyocytes उत्पन्न संभावना है. एकल कक्षों की परीक्षा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में एक तेजी से बढ़ते क्षेत्र है. एकल कोशिका के स्तर पर transcriptional स्तर की जांच करने का लाभ यह है कि यह एक शुद्ध सेल की आबादी है, जो पूरे ऊतकों की तैयारी से संभव नहीं है की परीक्षा की अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, एकल कक्ष विश्लेषण व्यक्ति की कोशिकाओं में mRNA स्तर के stochastic परिवर्तन की परीक्षा सेल आबादी है कि पहले सजातीय 8,9 लगा रहे थे परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है. जीन जो उनके जीन अभिव्यक्ति 10,11,12 में संभावित stochastic कर रहे हैं की पहचान करने के अलावा, विधि भी दुर्लभ सेल उनके जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल द्वारा परिभाषित आबादी की पहचान के लिए अनुमति देता है. हालांकि इस विधि जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण में रोमांचक क्षमता का उपयोग करता का एक नंबर प्रदान करता है, वहाँ रहे हैं सोमएकल कक्षों के उपयोग में ई निरंतर और विचार. एकल कक्ष विश्लेषण करने के लिए प्राथमिक सीमा, प्रयोग में पर्याप्त कोशिकाओं के संग्रह के लिए ब्याज की मीट्रिक संबंध के साथ उदाहरण के विचरण के लिए सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने है. मामलों में जहां ब्याज के ऊतकों से अलग कक्षों की संख्या एक सीमा नहीं है, एक समूह के प्रति कोशिकाओं के सैकड़ों की जांच, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, या nanofluidic सरणियों के रूप में इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग कर सकते हैं. हालांकि, कुछ मामलों में, वहाँ हित के ऊतकों से पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने में कठिनाई हो सकता है. इस हिस्से में लक्षित सेल प्रकार का संग्रह के लिए विशेष स्वभाव का समय गहन प्रक्रियाओं की वजह से किया जा सकता है. हालांकि, सावधान योजना और एकल कक्ष संग्रह के साथ आगे बढ़ने से पहले तैयारी अभी भी सीमित तकनीकी त्रुटि के साथ कठोर एकल कोशिका विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है. जब परिणाम यह विचार किया जाना चाहिए की जांच कि, भले ही अलग कोशिकाओं के लिए इस प्रक्रिया के कई studie में इस्तेमाल किया गया है(माइक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आदि सहित), अलगाव ही संभावित जीन की अभिव्यक्ति के प्रभाव सकता है. किसी भी विधि है जो जैविक नमूनों manipulates के साथ के रूप में, अपने निष्कर्षों के परिणामों को ध्यान करने के लिए सुनिश्चित करें एकल कक्ष अभिव्यक्ति ऊतक और ही नहीं तकनीकी पूर्वाग्रह के प्रतिनिधि है मान्य होना चाहिए. स्वस्थानी संकरण में के रूप में इस तरह के तरीके को बरकरार ऊतकों में इन परिणामों की पुष्टि करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है. अंत में, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सुनिश्चित करें कि डेटा उत्पन्न को ध्यान से गुणवत्ता नियंत्रण के लिए जाँच की है. 8 चित्रा में दिखाया गया डेटा दर्शाता है कि qPCR assays उनकी विशिष्टता में बहुत मजबूत हो सकता है, जैसे # 13 परख (A13) या परिवर्तनशीलता का एक उच्च स्तरीय है जो # 34 (A34) परख जैसे तकनीकी विचरण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvic एसिड </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> 2 MgCl </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> नाह 2 पीओ 4 एक समाक्षारीय </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> द्राक्ष - शर्करा </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> 2 CaCl </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protease, टाइप XIV </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, मैं टाइप करें </td><td> वर्थिंगटन </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x डीएनए सस्पेंशन बफर (10 मिमी Tris, पीएच 8.0, 0.1 मिमी EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> पी.एन. T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital सोडियम </td><td> हेनरी Schein डॉक्टर. आपूर्ति * </td><td> आदेश देने के लिए आपूर्तिकर्ता से संपर्क करें </td><td> * एक पशुचिकित्सा या प्रयोगशाला पशु पेशेवर के माध्यम से प्राप्त किया जाना चाहिए </td></tr><tr><td> आईटी ExoSAP </td><td> / Affymetrix USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> 2x Rxn मिक्स CellsDirect </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> सुपरस्क्रिप्ट III आरटी प्लेटिनम Taq मिक्स </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA प्राइमर मिक्स </td><td> IDT </td><td> रिवाज </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease मुफ्त पानी </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> WTA2 - 50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick पीसीआर शुद्धीकरण किट </td><td> क्विएज़न </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> क्विएज़न </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर </td><td>NanoDrop </td><td> 2000C </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer डीएनए किट 7500 </td><td> Agilent </td><td> 7500 किट </td><td></td></tr><tr><td> एक रंग लेबल किट </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k सरणी </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A स्कैनर </td><td> आण्विक डिवाइसेज </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex पूरा पूरे transcriptome प्रवर्धन किट (WTA2 किट) </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> WTA2 - 50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

जबकि कई अध्ययनों हृदय के ऊतकों के homogenates से जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों की जांच की है, यह एक ऊतक के भीतर कोशिकाओं के बीच निहित stochastic की भिन्नता का अध्ययन रोकता है. माउस दिलों की collagenase छिड़काव के माध्यम से शुद्ध cardiomyocyte आबादी के अलगाव पूरे transcriptome जीन की अभिव्यक्ति के लिए एकल कोशिका प्रोटीन की पीढ़ी है, या विशिष्ट nanofluidic सरणियों का उपयोग करते हुए लक्ष्य की qPCR की सुविधा. हम यहाँ दिल से अलग cardiomyocytes की एकल सेल जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच प्रक्रिया का वर्णन. इस प्रतिमान ब्याज की मैट्रिक्स है जो मतलब है पर निर्भर नहीं हैं (उदाहरण के एक ऊतक के भीतर कोशिकाओं के बीच विचरण के लिए), जो संभव नहीं है जब जीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन (चित्रा 1) के लिए पारंपरिक पूरे ऊतक वर्कफ़्लो का उपयोग नहीं है के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. हम डबल असहाय सीडीएनए एकल कक्ष transcriptome उपज micrograms है कि मैं पर प्रोटीन के उपयोग की सुविधा के मजबूत प्रवर्धन हासिल किया हैndividual कोशिकाओं. प्रक्रिया में हम NimbleGen सरणियों जो उपयोग और उनके डिजाइन को अनुकूलित करने के लिए की क्षमता के अपने आसानी के लिए चयन किया गया था का उपयोग का वर्णन करता है. वैकल्पिक रूप से, एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस - विशिष्ट लक्ष्य (आरटी एसटीए) प्रवर्धन प्रतिक्रिया, nanofluidic पीसीआर द्वारा लक्ष्य के सैकड़ों के qPCR के लिए अनुमति देता है. या तो इन तरीकों का उपयोग, यह अभिव्यक्ति की कोशिकाओं के बीच परिवर्तनशीलता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं के एक ऊतक के भीतर से अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच की जांच करने के लिए संभव है. कुल मिलाकर, एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति दृष्टिकोण डेटा है कि संभावित विशेष स्वभाव की अभिव्यक्ति प्रोफाइल है कि आम तौर पर बाहर औसत कर रहे हैं जब ठेठ पूरे ऊतकों से उत्पन्न homogenates से कोशिकाओं के लाखों लोगों की अभिव्यक्ति की जांच की पहचान कर सकते हैं की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है.

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

एकल सेल अभिव्यक्ति की रूपरेखा विस्तृत व्यक्ति की कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति देता है. हम cardiomyocytes के अलगाव के लिए विधियों का वर्णन है, और या तो पूरी transcriptome या विशिष्ट लक्ष्यों के माइक्रोएरे qPCR के लिए जिसके परिणामस्वरूप lysates की तैयारी है.

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While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

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Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

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लेजर की मदद से अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के Transcriptional प्रोफाइलिंग के लिए एक उपकरण के रूप में Microdissection (एलएएम)

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ट्रांस-इनर सेल भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन उच्च Chimerism दरों की ओर जाता है

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छोटी बूंद Barcoding-आधारित एकल कोशिका Transcriptomics वयस्क स्तनधारी ऊतकों

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

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Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

अलगाव, ट्रांसफैक्शन, और वयस्क माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...