Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
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Gli autori desiderano ringraziare per l&#39;assistenza tecnica di C. Zambataro durante le riprese di questo protocollo. Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno della Fondazione Glenn for Medical Research (SM), La fondazione Hillblom, e il National Institutes of Health per un premio Centro Shock Nathan (P30AG025708) e PO1AG025901. JMF è stato sostenuto da T32AG000266 assegnato al Buck Institute for Research on Aging.

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	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Accesso libero e la produzione di questo di questo articolo è sponsorizzato Sigma-Aldrich.</p

Questo metodo ha la possibilità di generare cardiomiociti per una serie di funzionali e studi di espressione genica. L&#39;esame di singole cellule è una zona fiorente in analisi di espressione genica. Il vantaggio di esaminare i livelli di trascrizione a livello della singola cellula è che permette l&#39;esame di una popolazione di cellule pure, che non è possibile dal preparazioni tessuto intero. Inoltre, l&#39;analisi singola cella consente per l&#39;esame di variazione stocastica dei livelli di mRNA nelle cellule individuali per definire popolazioni di cellule che in precedenza erano ritenuti omogenei 8,9. Oltre a identificare i geni che sono potenzialmente stocastici nella loro espressione genica 10,11,12, il metodo consente anche per l&#39;identificazione delle popolazioni cellulari rari definito dai profili gene loro espressione. Mentre questo metodo fornisce una serie di entusiasmanti possibilità di utilizzo in analisi di espressione genica, ci sono somavvertimenti e considerazioni e nell&#39;uso di singole cellule. Il limite principale ad analisi singola cella, è la raccolta di cellule sufficiente per l&#39;esperimento di raggiungere una significatività statistica per quanto riguarda la metrica di interesse, per esempio varianza. Nei casi in cui il numero di cellule isolate dal tessuto di interessi non è una limitazione, si può esaminare centinaia di cellule per gruppo, utilizzando approcci come sequenziamento di prossima generazione, o array nanofluidic. Tuttavia, in alcuni casi, ci possono essere difficoltà a ottenere cellule sufficienti dal tessuto di interesse. Questo può in parte essere causato da procedure momento idiosincratico intensivo per la raccolta del tipo di cellula bersaglio. Tuttavia, un&#39;attenta pianificazione e la preparazione prima di procedere con la raccolta singola cellula può ancora consentire una rigorosa analisi singola cellula con limitato errore tecnico. Quando l&#39;esame dei risultati deve essere considerato, che anche se questa procedura per le celle di isolamento è stato utilizzato in numerose Studies (tra cui microscopia, elettrofisiologia, ecc), lo stesso isolamento potrebbe potenzialmente effetto di espressione genica. Come per qualsiasi metodo che manipola i campioni biologici, i risultati delle indagini svolte deve essere attentamente convalidato per garantire l&#39;espressione singola cella è rappresentativo del tessuto stesso e pregiudizi non tecnico. Metodi come ibridazione in situ può risultare utile per verificare questi risultati nel tessuto intatto. Infine, è fondamentale per garantire che i dati generati viene accuratamente controllato per il controllo qualità. I dati riportati in figura 8 dimostra che i test qPCR può essere molto robusti nella loro specificità, come il saggio # 13 (A13) o hanno un elevato livello di variabilità che possono portare a variazioni tecniche come test # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acido piruvico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobasico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Destrosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasi, Tipo XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Tipo I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x Sospensione tampone del DNA (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio pentobarbital </td><td> Henry Schein Vet. Alimentazione * </td><td> Contattare il fornitore per l&#39;ordinazione </td><td> * Deve essere acquistato attraverso un laboratorio veterinario o animale professionale </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Mix RXN </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primer Mix </td><td> IDT </td><td> Costume </td><td></td></tr><tr><td> Nucleasi acqua gratis </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR kit di purificazione </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Spettrofotometro </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> Bioanalyzer DNA 7500 Kit </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> Un colore kit etichettatura </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k serie </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Completa intero kit di amplificazione trascrittoma (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Mentre numerosi studi hanno esaminato i cambiamenti di espressione genica da omogenati di tessuto cardiaco, questo impedisce studiando la variazione inerente stocastica tra le cellule all&#39;interno di un tessuto. Isolamento delle popolazioni di cardiomiociti pura attraverso una perfusione collagenasi dei cuori del mouse facilita la generazione di microarray singola cella per tutta l&#39;espressione genica trascrittoma, o qPCR di obiettivi specifici utilizzando gli array nanofluidic. Descriviamo qui una procedura per esaminare le singole cellule profili di espressione genica dei cardiomiociti isolati dal cuore. Questo paradigma permette per la valutazione delle metriche di interesse che non dipendono dalla media (per esempio la varianza tra le cellule all&#39;interno di un tessuto) che non è possibile quando si utilizza tessuti tradizionali flussi di lavoro intero per la valutazione dell&#39;espressione genica (Figura 1). Abbiamo raggiunto l&#39;amplificazione robusta del trascrittoma microgrammi singola cellula cedimento di cDNA doppio filamento che facilita l&#39;uso di microarray su icellule ndividual. Nella procedura viene descritto l&#39;uso di array NimbleGen che sono stati selezionati per la loro facilità d&#39;uso e possibilità di personalizzare il loro design. In alternativa, un trascrittasi inversa - amplificazione del target specifico (RT-STA) di reazione, permette di qPCR di centinaia di obiettivi da parte nanofluidic PCR. Utilizzando uno di questi due approcci, è possibile esaminare la variabilità di espressione tra le cellule, così come l&#39;esame di profili di espressione di tipi di cellule rare all&#39;interno di un tessuto. Nel complesso, il singolo gene approccio cellula espressione permette la generazione di dati che sono potenzialmente in grado di identificare profili di espressione idiosincratica che sono tipicamente mediati in sede di esame l&#39;espressione di milioni di cellule da omogenati tipici generati dai tessuti interi.

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Singoli profili di espressione delle cellule consente la dettagliata analisi di espressione genica di cellule singole. Noi descrivere i metodi per l&#39;isolamento dei cardiomiociti, e preparare il lisati risultante sia per microarray intero trascrittoma o qPCR di obiettivi specifici.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

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