Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
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著者らは、このプロトコルの撮影の間にC. Zambataroの技術支援に感謝します。我々は感謝グレンネイサンショックセンター賞のための医学研究（SM）、Hillblom基礎、および国立衛生研究所財団（P30AG025708）とPO1AG025901のサポートを認める。 JMFは、老化研究のためにバック研究所に授与T32AG000266によってサポートされていました。

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	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"この記事のこれの&gt;フリーアクセスと生産はSigma - Aldrich後援される。</p

このメソッドは、機能の数だけでなく、遺伝子発現研究のための心筋細胞を生成する可能性があります。単一細胞の検査は、遺伝子発現解析で急成長領域です。単一細胞のレベルでの転写レベルを調べることの利点は、全体の組織調製物から可能ではない純粋な細胞集団の検査を、できることです。さらに、単一細胞の分析は、以前に8,9均質であると考えられていた細胞集団を定義するために個々の細胞におけるmRNAレベルの確率的変動の検討が可能になります。それらの遺伝子発現10,11,12で潜在的に確率的な遺伝子を同定に加えて、この方法はまた、それらの遺伝子発現プロファイルで定義されている希少細胞集団の同定が可能になります。 このメソッドは、遺伝子発現解析でエキサイティングな潜在的な用途の数を提供する一方で、SOMがあります単一細胞の使用中の電子の注意点と考慮事項。単一細胞解析の主な制約は、例えば分散のために、関心のメトリックに関しては統計的有意性を達成するために実験に十分な細胞の集まりです。関心の組織から単離された細胞の数が制限されていない場合は、いずれかがこのような次世代シーケンシング、またはナノ流体アレイなどのアプローチを使用して、グループごとに細胞数百を調べることができます。しかし、いくつかのケースでは、関心の組織からの十分な細胞を得ることが困難があるかもしれません。これは、部分的に標的細胞のタイプの収集のための特異な時間集約的な手続きによって引き起こされる場合があります。しかし、単一のセルのコレクションを進めるために慎重な計画と事前の準備はまだ限られた技術的なエラーと厳密な単一細胞解析のためにできる可能性があります。結果を検査する際には、細胞を単離するために、この手順は、多数のstudieで使用されているにもかかわらずこと、を考慮する必要がありますsは（顕微鏡、電気生理学、等を含む）、分離自体は潜在的に遺伝子発現に影響ことができます。生物学的サンプルを操作する任意のメソッドと同様に、あなたの調査結果の結果は慎重に、単一細胞の発現を確実に検証しなければなりません組織自体ではなく、技術的なバイアスの代表です。このようなin situハイブリダイゼーションなどのメソッドは、無傷の組織でこれらの結果を検証するために有用であろう。最後に、生成されたデータは慎重に品質管理のために選択されていることを確認することが重要です。図8に示すデータは、qPCRアッセイはそのようなアッセイ＃13（A13）として、その特異性に非常に堅牢であることまたはそのようなアッセイ＃34（A34）のような技術的な分散につながることができる可変性の高いレベルを持っている可能性があることを示しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2の </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4一塩基</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOHで</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2で </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ、タイプXIV </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td>コー​​ラgenaseは、タイプI </td><td>ワージントン</td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1XのDNAのSuspension Buffer（10 mMトリス、pH 8.0、0.1mMのEDTA） </td><td> TEKnova、 </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>ヘンリーシャインの獣医。供給* </td><td>発注するときはサプライヤーにお問い合わせください</td><td> *獣医師や実験動物専門家を通じて調達する必要があります。 </td></tr><tr><td> ITをExoSAP </td><td>アフィメトリクス/ USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> 2倍RXNミックスをCellsDirect </td><td>インビトロジェン</td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td>スーパースクリプトIII RTプラチナTaqポリメラーゼミックス</td><td>インビトロジェン</td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT - STAのプライマーミックス</td><td> IDT </td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> WTA2 - 50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAクイックPCR精製キット</td><td>キアゲン</td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td>キアゲン</td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td>光度計分光光度計</td><td>光度計</td><td> 2000C </td><td></td></tr><tr><td>バイオアナライザDNA 7500キット</td><td>アジレント</td><td> 7500キット</td><td></td></tr><tr><td> Oneカラーラベリングキット</td><td>ロシュ、NimbleGen社</td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td>ハツカネズミ12x135kの配列</td><td>ロシュ、NimbleGen社</td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200Aスキャナ</td><td>分子デバイス</td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex完全に全トランスクリプトーム増幅キット（WTA2キット） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> WTA2 - 50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

多くの研究は、心臓組織のホモジネートからの遺伝子発現の変化を検討してきたが、これは組織内の細胞間の固有の確率的変動を研究する防ぎます。マウスの心臓のコラゲナーゼ灌流を通して純粋な心筋細胞集団の分離は、全トランスクリプトーム遺伝子発現、またはナノ流体アレイを使用して特定のターゲットの定量PCRのための単一細胞マイクロアレイの生成を促進する。ここでは、心臓から単離された心筋細胞の単一細胞の遺伝子発現プロファイルを調べるために手順を説明します。このパラダイムでは、遺伝子発現の評価（図1）ため、従来の全組織のワークフローを使用する場合は不可能である（組織内の細胞の間に例の分散のための）意味に依存していない関心のメトリックの評価することができます。我々は、iのマイクロアレイの利用を促進する二本鎖cDNAの単セルのトランスクリプトーム収量マイクログラムの堅牢な増幅を実現していますndividual細胞。手順では、使用すると、そのデザインをカスタマイズする機能の容易さのために選択されたNimbleGen社配列を使​​用する方法を説明します。また、逆転写酵素 - 特定のターゲットの増幅（RT - STA）反応は、ナノ流体PCRによるターゲットの数百の定量PCRが可能になります。これらのアプローチのいずれかを使用して、それは細胞間の発現の変動だけでなく、組織内から珍しい種類の細胞の発現プロファイルを調べることを検討することが可能です。全体的に、単一細胞の遺伝子発現のアプローチは、潜在的に全体の組織から生成される典型的なホモジネートから細胞の数百万の発現を調べるときに典型的に平均化されている特異な発現プロファイルを識別できるデータを生成することができます。

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

単一細胞の発現プロファイリングは、個々の細胞の詳細な遺伝子発現解析が可能になります。我々は心筋細胞の単離のための方法を説明し、特定のターゲットの全トランスクリプトームのマイクロアレイや定量PCRのどちらかの結果のライセートを調製した。

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

マウス神経組織から単細胞懸濁液の生成

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

マウス心筋細胞の単離と生理解析

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

哺乳類の成体の液滴バーコード ベースの単一細胞トランスクリプトーム

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...