Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
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저자는이 프로토콜의 촬영 기간 동안 C. Zambataro의 기술 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 기꺼이 글렌 네이선 충격 센터 상을 의학 연구 (SM), Hillblom 재단과 국립 보건원에 대한 재단 (P30AG025708)와 PO1AG025901의 지원을 인정합니다. JMF는 노화 연구에 대한 책임 연구원에게 수여 T32AG000266에 의해 지원되었다.

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	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"이 문서의&gt; 무료 접속이 생산은 시그마 - 올드 리치를 후원합니다.</p

이 메서드는 기능의 숫자뿐만 아니라 유전자 발현 연구에 대한 cardiomyocytes를 생성할 수있는 가능성이 있습니다. 단일 세포의 검사는 유전자 발현 분석에 급성장 지역입니다. 단일 세포 수준에서 transcriptional 수준을 검토의 장점은 전체 조직의 준비에서 가능하지 않은 순수한 세포 인구의 시험을 허용한다는 것입니다. 또한, 단일 세포 분석은 이전에 균질 8,9 것으로 생각되었다 세포 인구를 정의하는 각각의 세포에서 mRNA 수준의 확률적 변화의 시험을 수 있습니다. 자신의 유전자 표현 10,11,12에 잠재적으로 확률적 아르 유전자를 식별하는 이외에 방법은 또한 유전자 발현 프로파일에 의해 정의된 희귀 세포 집단의 식별을 허용합니다. 이 방법은 유전자 발현 분석에 흥미로운 가능성이 사용하는 다수의를 제공하고 있지만, som있다단일 세포의 사용에 전자주의 사항 및 고려 사항. 단일 세포 분석에 기본 제한은, 예를 들어 분산에 대한 관심의 메트 릭에 관련하여 통계적 중요성을 달성하기 위해 실험에서 충분한 세포의 모음입니다. 관심의 조직으로부터 격리 세포의 숫자가 제한되지 않습니다 경우에, 하나는 같은 차세대 시퀀싱, 또는 nanofluidic 배열과 같은 접근법을 사용하여 그룹 당 세포의 수백을 확인하실 수 있습니다. 하지만 일부 경우에, 관심의 조직에서 충분한 세포를 얻기에 어려움이있을 수 있습니다. 이 부분에서 대상 셀 형식의 컬렉션에 대한 특이한 시간 집중 과정으로 인해 발생할 수 있습니다. 그러나, 단일 셀 컬렉션을 진행하기 위해 신중 계획과 사전 준비는 여전히 제한된 기술 오류와 함​​께 엄격한 단일 세포 분석을 위해 허용할 수 있습니다. 그것이 고려되어야 그 결과를 검토하면, 세포 분리에 대해이 절차는 여러 studie에 사용되었습니다 비록 그s이 (현미경, 전기 생리학, 등), 격리 자체는 잠재적으로 유전자 발현에 영향을 수 있습니다. 생물 학적 샘플을 조작하는 방법과 마찬가지로, 당신의 결과의 결과를주의 깊게 단세포 표현은 조직 자체 기술하지 편견 대표하기 위해 검증해야합니다. 이러한 현장 하이브 리다이 제이션에서와 같이 방법은 손상 조직에서 이러한 결과를 확인하기 위해 유용합니다. 마지막으로, 그것은 생성된 데이터가 신중하게 품질 관리를위한 체크되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 그림 8에 표시된 데이터는 qPCR의 assays 이러한 분석 # 13 (A13)와 같은, 그들의 특이성이 매우 강력한하거나 그러한 분석 # 34 (A34)와 같은 기술적인 변화로 이어질 수있는 다양성의 높은 수준을 가지고 수 있습니다 보여줍니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 71,378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 60,128 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 54,457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 일염기의 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> 우선당 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 72,068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 21,115 </td><td></td></tr><tr><td> 단백 분해 효소, 유형 XIV </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, 전을 입력합니다 </td><td> 워싱턴 </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1X의 DNA 서스펜션 버퍼 (10 MM 트리스, 산도 8.0, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital 나트륨 </td><td> 헨리 Schein의 투어뇌려. 공급 * </td><td> 주문에 대한 공급 업체에 문의하십시오 </td><td> *는 수의사 또는 동물 전문 연구소를 통해 procured되어야합니다 </td></tr><tr><td> IT를 ExoSAP </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78,201 </td><td></td></tr><tr><td> 2X Rxn 믹스를 CellsDirect </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> 윗첨자 III RT 플래티넘 DNA 형성 촉매 믹스 </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT - STA의 뇌관 믹스 </td><td> IDT </td><td> 사용자 정의 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease 무료 물 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> WTA2 - 50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick PCR 정화 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9,001,292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 분광 광도계 </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA 7500 키트 </td><td> 애질런트 </td><td> 7500 키트 </td><td></td></tr><tr><td> 한 컬러 라벨링 키트 </td><td> 호슈 - NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> 뮤스 Musculus 12x135k 어레이 </td><td> 호슈 - NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A 스캐너 </td><td> 분자 장치 </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex 완전한 전체 Transcriptome 증폭 키트 (WTA2 키트) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> WTA2 - 50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

수많은 연구 심장 조직의 homogenates에서 유전자 발현 변화를 조사하고 있지만, 이것은 조직 내의 세포 사이의 고유의 확률적 변화를 공부하고 방지할 수 있습니다. 마우스 마음 collagenase 재관류를 통해 순수한 cardiomyocyte 인구의 격리는 전체 transcriptome 유전자 발현에 대한 단세포 microarrays의 생성, 또는 nanofluidic 배열을 사용하여 특정 대상의 qPCR을 용이하게합니다. 우리는 여기서 마음에서 격리 cardiomyocytes의 단일 세포 유전자 발현 프로파일을 조사하는 절차를 설명합니다. 이 패러다임은 유전자 발현의 평가 (그림 1) 종래의 전체 조직 워크플로를 사용 가능한 경우는 아니지만 (조직 내의 세포 사이의 예제 분산을위한) 의미에 의존하지 않습니다 흥미 통계 평가 수 있습니다. 우리는 전에 microarrays의 사용을 용이하게 이중 좌초 cDNA의 단일 세포 transcriptome 항복 마이크로 그램의 강력한 증폭을 달성ndividual 세포. 절차에서는 사용하고 자신의 디자인을 사용자 정의할 수있는 기능들의 편리를 위해 선택되었다 NimbleGen 배열의 사용을 설명합니다. 또는 반대 transcriptase - 구체적인 목표 증폭 (RT - STA) 반응, nanofluidic PCR에 의한 대상의 수백 qPCR을 허용합니다. 어느 이러한 방식을 사용하여, 그것은 세포 사이의 표현의 다양성뿐만 아니라, 조직 내에서 드문 세포 유형의 표현 프로필을 검토을 검토하는 것이 가능합니다. 전반적으로, 단일 세포 유전자 표현 방식은 잠재적으로 전체 조직에서 생성된 전형적인 homogenates의 세포 수백만의 표현을 조사했을 때 일반적으로 밖으로 평균 아르 특이한 표현 프로파일을 식별할 수있는 데이터의 생성을 허용합니다.

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

드롭릿 바코드 기반 단일 셀 Transcriptomics 성인 포유류 직물의

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

성인 마우스및 쥐 심근세포의 격리, 트랜스페션 및 장기 문화

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...