Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke teknisk assistanse av C. Zambataro under filmingen av denne protokollen. Vi ønsker å takke for støtte av Glenn Foundation for Medical Research (SM), The Hillblom foundation, og National Institutes of Health for en Nathan Shock senter award (P30AG025708) og PO1AG025901. JMF ble støttet av T32AG000266 tildelt Buck Institute for Research on Aging.

1. Trinn 1 - Cardiomyocyte isolasjon <ol><li> Klargjør fordøyelsen buffer som følger: 10 x Fordøyelse buffer (laget i ultra-ren H 2 O) <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endelig Kons. </td><td> g / L </td><td> g/500 mL </td><td> 10x løsning g / L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 mm </td><td> 7.597 </td><td> 3.3 </td><td> 75.97 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mm </td><td> 0.4 </td><td> 0.2 </td><td> 4.0 </td></tr><tr><td> Pyruvic syre </td><td> 3 nM </td><td> 0,33 </td><td> 0.165 </td><td> 3,30 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 25 mm </td><td> 5,96 </td><td> 2,85 </td><td> 59,6 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,5 mm </td><td> 0.101 </td><td> 0,05 </td><td> 1,01 </td></tr><tr><td> NaH 2PO 4monobasic </td><td> 0,33 mM </td><td> 0,04 </td><td> 0,02 </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Dekstrose </td><td> 22 mm </td><td> 3,96 </td><td> 1,98 </td><td> 39,6 </td></tr></tbody></table> pH buffer til 7,4 med NaOH </li><li> Bruke 10x Digestion buffer, gjør følgende fire løsninger for hvert hjerte som vil bli perfused (laget i ultra-ren H 2 O): </li></ol> Fordøyelse Buffer A (Lag tre alikvoter av denne løsninger) <ul><li> 50 ml - 1x Fordøyelse buffer som inneholder: <ul><li> 75 mL - EGTA løsning (100 mM EGTA) </li></ul></li></ul> Fordøyelse Buffer B (Lag en av disse) <ul><li> 25 ml - 1x Fordøyelse buffer som inneholder: <ul><li> 1,25 mL - CaCl 2 Solution (1 M) </li><li> 1 mg - Protease </li><li> 25 mg - collagenase (can også bruke 75% av dette beløpet = 18,75 mg) ** </li></ul></li></ul> Innsamling Buffer (Lag en av disse) <ul><li> 2,5 ml - 1x Fordøyelse buffer som inneholder: <ul><li> 1,25 mL - CaCl 2 Solution (1 M) </li><li> 0,5 mg - Protease </li><li> 15 mg - collagenase (75% = 11,25 mg) ** </li><li> 125 mg - BSA </li></ul></li></ul> Nøytralisering vaskebuffer (Lag en av disse) <ul><li> 25 ml - 1x Fordøyelse buffer som inneholder: <ul><li> 6,25 mL - CaCl 2 Solution (1 M) </li><li> 250 mg BSA </li></ul></li></ul> ** Avhengig av kilde og batch av collagenase kan enzymaktiviteten variere. Det kan være nødvendig å optimalisere mengden av enzym lagt til denne buffer for å unngå over-fordøyelsen. <ol start="3"><li> Sett opp isolasjon systemet som tidligere beskrevet i detail 1,2 med tre 15 mL begerglass med fordøyelsen Buffer A på is, en 50 ml tube Fordøyelse buffer A og 25 mL Fordøyelse Buffer B klar for perfusjon (Fordøyelse Buffer En bør spyles gjennom linjen, på minimum 5 ml kjøres gjennom systemet), varmet Innsamling buffer i et vannbad for å øke temperaturen til 37 ° C, og nøytralisering vaskebuffer ved RT. </li><li> Fyll perfusjon kanyle og disseksjon parabolen der hjertet skal være rengjort og bundet på blodgjennomstrømning spissen med kalde Fordøyelse Buffer A. løst knute noen sutur (4-O til 6-O størrelse) rundt den øvre delen av kanylen. Dette vil senere bli brukt til å holde aorta for å forebygge hjerte slipping av kanyle. </li><li> Terminalt sedate musen med en IP injeksjon av anestesimiddel (0,25 ml Sodium Pentobarbital løsning) og sikre at musen er bevisstløs og ikke reagerer på smerte stimuli. Skjær åpne brysthula forsiktig langs thorax margin ved å kutte mellomgulvet(Figur 2). Cut overlegent oppover og reflektere fremre brystkasse (disse snittene blir utpekt B og A, henholdsvis i figur 2) Kritisk -. Musen må fortsatt være å puste før disse snitt. </li><li> Ved hjelp av en plast pipette kuttes til ønsket størrelse forsiktig suger hjertet inn i pipetten. Klipp hjertet ut av brysthula er forsiktig med å forlate nok av aorta på hjertet å klart identifisere aorta gren (figur 3). En pipette er brukt siden det forårsaker minimal skade på hjertet. </li><li> Drop hjertet til en beger av iskald Fordøyelse buffer A og skyll blodet vekk. Etter 15-45 sek plassere hjertet inn i andre beger av iskald Fordøyelse Buffer A til kort skylle igjen. Overfør hjerte i petriskål også fylt med kaldt Fordøyelse Buffer A. </li><li> Se hjertet i fatet med fordøyelsen buffer A under disseksjon omfang og nøye isolere aorta og dens forgreninger. Skjær forsiktig bare dårligere de siste branch (figur 4). </li><li> Sett på kanylen tuppen inn i aorta og ligate på plass med 4-O til 6-O sutur med sceneoppsett under en disseksjon mikroskop. Kontroller at kanylen ikke sitter for lavt i aorta og forblir over koronararteriene (figur 4). </li><li> Med Fordøyelse Buffer En strømmer gjennom perfusjon oppsettet, plasserer perfusjon tips videre til oppsettet, og begynne å perfuse hjertet til de fleste av blod er vasket fra hjertet og væske forlater hjertet er klar. Kritisk - temperaturen på perfusjons væske må være så nært som mulig til 37 ° C når det kommer ut av kateteret. Hvis løsningen er for varmt eller for kaldt så perfusjon vil drepe vevet. Tiden frem til perfusjon av hjertet er også kritisk. Tiden vinduet må være mindre enn 5-10 min fra fjerning av hjertet til perfusjon begynner. Hjertet må fjernes under narkose, ikke CO 2 affixation eller cervikal forvridning. </li><li> Når blodet varHed fra hjertet, bytte til fordøyelsen Buffer B fra fordøyelsen Buffer A. Sørg for at fordøyelsen buffer B er nå strømmer gjennom hjertet. Løsningen vil begynne å ha en gul fargetone. Vent 2-3 min til hjertet viser tegn til å miste sin form og begynner å se runde, som er en indikasjon på at fordøyelsen fungerer. Hjertemuskelen skal vises lysere som perfusjon provenyet. </li><li> Skjær ventriklene av med saks og plasser i en 50 ml konisk tube inneholder 15 mL av samlingen buffer ved 37 ° C. Forsiktig kuttet ventrikkelen i små biter mens du setter vevet inn i samlingen Buffer. Bland forsiktig med en plast pipette å oppløse celle-celle adhesjon og lage en enkelt celle cardiomyocyte blanding. </li><li> Når det meste av vevet er oppløst, (mindre enn 1 min) la større vev stykker synke til bunns. Fjern og lagre supernatanten til en 15 mL konisk tube. La tyngdekraften trekker en pellet fra supernatanten over 10 til 20 min (15min foretrukne) ved romtemperatur. </li><li> Fjern og kast supernatanten. Vask pellet ved å tilsette 5 mL av nøytralisering Wash Buffer til pellets og forsiktig bland cellene til resuspender dem. På dette punktet cellene er straks klar til å bli valgt for enkelt celle analyse (gå videre til trinn 2). </li></ol> 2. Trinn 2 - Isolering av enkeltceller <ol><li> Utarbeide en micromanipulator hjelp av en flamme og et glass kapillarrør som vil bli brukt til å manipulere celler. Den micromanipulator er rett og slett et veldig fint kapillarrør som deretter festet til et langt stykke av fleksible rør som kan flytte eller plukke opp cellene når suging er brukt. </li><li> Umiddelbart videre til valg av de enkelte cellene under et mikroskop (Nikon Eclipse TS100, 20x) med en micromanipulator som ble opprettet med et trukket pipette og en luftslusen for å hindre at materiale blir overført til den enkle celleprøver prøven. Sørg for at cellen befolkningen er sunt(70% levedyktige) og ikke skadet fra isolasjon prosessen. </li><li> Fortynne celler ned i en liten petriskål slik at de kan velges individuelt. Når du skal løfte celler være sikker på å fange opp cellene i et lite volum (mindre enn 2 mL). Velg bare friske celler som har den særegne normal cardiomyocyte morfologi (Figur 5). </li><li> Plasser individuelle celler inn i bunnen av individuelle PCR rør og fryse dem umiddelbart på tørris. Disse cellene blir deretter lagret ved -80 ° C til de er skal brukes til genekspresjonsanalyse. </li></ol> 3. Trinn 3A - Single celle qPCR genekspresjon For å utføre qPCR på enkeltceller ansette en protokoll tilpasset fra en utviklet for enkelt celle genuttrykk ved Fluidigm Corporation for sine Biomark nanofluidic qPCR arrays (Fluidigm - Advance Development Protocol # 30) 3,4. <ol><li> Forberedelse av revers transkripsjon - Spesifikk Target Amplification (RT-STA). Å væregin, resuspender alle primer parene (vi har brukt opp til 125 primer parene hell) for genene av interesse på 100 mikrometer i 1x DNA suspensjon buffer (10 mM Tris, 8,0 pH, 0.1 mM EDTA). Kombiner og ytterligere fortynnes forover og revers primer parene til 20 mM for hver analyse. Til slutt, fortynne alle primer parene til én løsning med en endelig konsentrasjon på 200 nM for hver analyse som vil bli forsterket i RT-STA reaksjon. For å gjøre dette, ta hver primer par og fortynne dem 1:100. For eksempel, hvis du har 30 assay primer parene ved 20 mM, må du legge til 1 mL av hvert par (30 mL totalt), og deretter gjøre opp resten av volumet med 70 mL av DNA suspensjon buffer for å nå finalen fortynningsvolum på 100 mL. </li><li> Nå som primer løsninger er forberedt, montere RT-STA reaksjon mester mix. Forbered nok mestre miks for hver av de individuelle cellene du ønsker å forsterke. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volum i mL (per reaksjon) </td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Reaction mix </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> Hevet III RT Plantinum Taq mix </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> RT-STA Primer mix (200 nM hver analyse) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nukleasefritt Free H 2 O (eller 1x DNA suspensjon buffer) </td><td> 1.3 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 9.0 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. RT-STA mester mix </li><li> Umiddelbart fjerne frosne celler og sentrifuger ved maksimal RCF i 30 sekunder for å sikre at cellene er plassert på bunnen av røret. Legg til 9 mL av RT-STA mix til røret og fortsette til reaksjon i en thermocycler. <ol class="lalpha"><li> 50 ° C - 15 minutter </li><li> 95 ° C - 2 minutter </li><li> 18 sykluser med <ol class="lroman"><li> 95 ° C i 15 sekunder </li><li> 60° C i 4 minutter </li></ol></li><li> Hold ved 4 ° C </li></ol></li><li> Fjern rørene fra PCR maskinen og legge 4 mL av ExoSAP-IT til reaksjonen. ExoSAP-IT er en PCR opprydding reagens som vil fjerne overflødig primere og enzym fra RT-STA reaksjon. Kjør rørene gjennom følgende reaksjon i en PCR maskin. <ol class="lalpha"><li> 37 ° C - 15 minutter </li><li> 80 ° C - 15 minutter </li><li> Hold ved 4 ° C </li></ol></li><li> Når ExoSAP-IT behandlingen er fullført, fortynne prøvene 01:05 med DNA suspensjon buffer. Prøvene er nå forberedt på qPCR analyse. Vi bruker dette materialet i forbindelse med Fluidigm er Gene uttrykket qPCR Arrays (48.48 eller 96.96 plater). Det er også mulig å bruke denne tilnærmingen med mer tradisjonelle qPCR instrumentering (96 godt eller 384 vel formater). Men disse instrumentene vanligvis krever mye mer sample innspill som begrenser antallet tester som kan performed fra en enkelt celle. </li></ol> 3. Trinn 3B - Hele transkriptom forsterkning og microarray av enkeltceller Utvinning og Amplification <ol><li> Bruk Sigma WTA2 kit (Cat # WTA2) for å forsterke doble strandet cDNA fra både pellets og enkeltceller. Enkeltceller er &quot;ut&quot; via det første trinnet i Sigma WTA2 protokollen i henhold til produsentens anvisninger. I løpet av dette første trinnet i inkubasjon med bibliotek syntese buffer ved 37 ° C i 5 minutter forstyrrer membran av enkeltceller og &quot;ekstrakter&quot; budskapet for forsterkning. </li><li> Forsterke enkeltceller i to omganger, med retningslinjene fra Sigma-Aldrich er WTA2 kit. Utfør biblioteket prep skritt i henhold til produsentens protokoll, deretter tilsett 1 / 5 av biblioteket prøven til 70 mL av WTA2 forsterkning Master Mix. Forsterke prøvene i 25 sykluser med anbefalte sykling parametere. </li><li> Rense prøvene USIng Qiagen er QIAquick PCR Rensing Kit (Cat # 28104) og prosessen på Qiagen er Qiacube bruke &quot;Cleanup QIAquick PCR Amplification Reaksjoner Standard V4&quot; protokollen. </li><li> Konsentrere renset prøvene til 5 mL, med en hastighet vakuum, og satt gjennom en andre runde med forsterkning i 17 sykluser (WTA2 forsterkning protokollen og sykling parametre gjentas). </li><li> Rense prøver å bruke QIAquick PCR Rensing Kit og sjekke kvaliteten ved hjelp av en NanoDrop spektrofotometer og Agilent er BioAnalyzer DNA 7500 kit henhold til produsentenes protokollen. </li></ol> Merking og NimbleGen Gene Expression Arrays <ol start="6"><li> Etikett 2 mikrogram av dobbel strandet cDNA fra hver forsterket celle prøve å bruke NimbleGen One Color Labeling Kit (Cat # 05223555001) i henhold til produsentens protokollen. </li><li> Hybridize 5 mikrogram Cy3 merket prøve til Mus musculus 12x135k, NimbleGen Gene Expression Arrays (Cat # 05543797001) accOrding til produsentens protokollen. Etter hybridisering av prøvene til arrays, bør slides deretter vaskes og tørkes før de kan avbildes på en laser skanner. </li><li> Scan Gene Expression Arrays hjelp av en laser skanner. Her bruker vi en Molecular Devices GenePix 4200A skanner med innstillinger 100POW, og 300-350PMT. Deretter generere paret filer for hver matrise med NimbleGen er NimbleScan programvare og deretter analysere for hele transkriptom uttrykk fra hver enkelt celle array (en tabell over typiske stabilt uttrykt cardiomyocyte vitnemål inngår som et supplement; tabell S1). </li></ol> Hvis hjertet perfusjon fungerte bra det bør være en høy prosentandel av sunt hjerte celler som beholder sine typiske rektangulær morfologi på isolasjon. Hvis perfusjon ikke gå bra da blir det en stor andel av døde celler (se bilder i Figur 5). Hvis cellene er riktig forsterkes ved hjelp av enten WTA2 eller RT-STA metoder den sluttproduktene skal passere etterfølgende kvalitetskontroll tester for kvaliteten av mRNA prøver med NanoDrop og BioAnalyser (figur 6). For microarray arbeidsflyt, dette er fullført etter WTA forsterkning hvor mRNA er testet av både NanoDrop og Bioanalyzer. Representant positive resultater for denne analysen er vist i Figur 6. Den WTA2 prøvene skal vise en robust forsterkning med både NanoDrop spektrofotometer lesing, samt electropherogram avlesning fra Bioanalyzer (BA) chip (figur 6). En tabell av gener som var stabilt oppdaget via microarray av enkeltceller inngår som et eksempel (tabell S1). For qPCR prosessen, kan kvaliteten på data vurderes ved å utføre en smelte steg på slutten av PCR reaksjonen for å sikre at primer sett er forsterke ønsket produkt (figur 7). Hvis den er riktig, bør dette smelte trinnet generere en bestemt smelte peak. For å illustrere dette poenget, er en undergruppe av nanofluidic qPCR data vist i en heatmap av peak smelte temperature (Figur 8) 8. Det er mulig å vurdere kvaliteten av et PCR produkt av sin smelte temperatur for å sikre fravær av ikke-spesifikke produkter 5. Hver rad av dette kartet representerer en celleprøve (S1-S40) testet i 43 separate qPCR assays (A1-A43). I dette tallet er det klart at enkelte analysene er ganske variabel, og er trolig mindre pålitelige enn de mer stabile analyser med høyere PCR spesifisitet. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Oversikt over én celle isolasjon og genekspresjonsanalyse. Prosedyren vil demonstrere kirurgisk fjerning av mus hjertet og isolering av individuelle cardiomyocytes. Metodene diskutert i denne prosedyren omfatter metoder for enten qPCR eller microarray analyse etter hele transkriptom forsterkning (WTA). WTA prosedyre begynner med lysis (A) da bindingen av Sigma universelle primere (B) til mRNAbassenget. Utvidelsen av disse primere (C) og forsterkning (D) fase skape mikrogram forsterket materiale. Denne forsterkningen er da gjentas (E) for å generere nok materiale for microarray prosedyren. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Representasjon av plasseringen av snittene å fjerne hjertet fra musen. Skjær langs laterale veggen av brystkassen (A), deretter klippe langs underlegne margin på brystkassen (B). Cutting fartøy over og under hjertet tillater fjerning samtidig forlater nok av aorta til cannulate hjertet. Bilder tilpasset fra MJ Cook seks. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Diagram av thorax av musen. De stiplede linjene indikerer plasseringen av snittene (A) for excising hjertet fra brysthula uten å skade h<html> Mullen Fire vev. Bilder tilpasset fra MJ Cook seks. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Bilde av aorta bue og dets grener. Den grå linjen viser den ideelle plasseringen av hvor du skal trimme hovedpulsåren (A). De resterende aorta festet til hjertet er cannulated slik at tuppen av kanylen (B) går til riktig nivå i aorta (C). Bilder tilpasset fra F. Gaillard 7. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5. Utvelgelse av enkeltceller for genekspresjonsanalyse. Hvert panel viser cardiomyocytes fotografert under lysmikroskop viser typisk morfologi cardiomyocytes. Sunn cardiomyocytes er merket med de grønne pilene. Celler som er døde eller døende er vist med røde piler. Disse døde cellene må ikke brukes i analysen. iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg &quot;alt =&quot; Figur 6 &quot;/&gt; Figur 6. Kvalitetskontroll WTA resultater for enkelt celle forsterkning. (A) Bilde av en NanoDrop spektrofotometer avlesning som passer for den forsterkede karakterutskrifter fra WTA reaksjon. (B) Den avlesning fra BioAnalyzer chip viser resultater fra tre forsterket celler. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig7.jpg" alt="Figur 7" /> Figur 7.. QPCR forsterkning kurver (Venstre diagram) og peak smelte temperaturkurver (Høyre diagram). (A) Uttrykket resultater fra en kvalitet analysen er vist med en enkelt smelte peak tross for ulike forsterkning kurver. (B) Smelt kurver for en fattig primer sett, som har svært variabel smelte topper som ikke er ideelt for uttrykk analyse. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig8.jpg" alt="Figur 8" /> Figur 8. Kvalitetskontroll resultater for enkelt celle qPCR reagereioner. Denne varmen kartet ble opprettet for å vise smelte temperaturer som en fargeskala. Toppen smelte temperatur for hver qPCR analysen (A1-A43) er vist for 40 individuelle celler (S1-40). Analysene ble gruppert etter deres smelte temperatur. Ved å se nedover kolonnen for hver analyse er det mulig å se variasjonen smelte på tvers av alle prøvene. Dette tallet viser at noen qPCR analysene er svært spesifikke, mens andre er svært variabel og dermed er ikke egnet for enkelt celle analyse. Tabell S1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3302/TableS1_array.csv">Supplemental bordet av microarray data.</a> Disse genene er oppført i henhold til robusthet hvor de er påvist i én cardiomyocytes over et større datasett. Dette genet Listen indikerer sensitivitet for deteksjon for en rekke gener som er typisk uttrykt i single cardiomyocytes.

<ol>
	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Fri tilgang og produksjon av dette i denne artikkelen er sponset Sigma-Aldrich.</p

Denne metoden har muligheten til å generere cardiomyocytes for en rekke funksjonelle samt genuttrykk studier. Undersøkelse av enkeltceller er et gryende område i genekspresjonsanalyse. Fordelen med å undersøke transcriptional nivåer på nivået av enkelt celle er at det tillater undersøkelse av en ren celle befolkning, som ikke er mulig fra hele vevspreparater. I tillegg gir enkelt celle analyse for undersøkelse av stokastiske variasjon av mRNA nivåer i individuelle celler for å definere celle populasjoner som tidligere ble antatt å være homogen 8,9. I tillegg til å identifisere gener som er potensielt stokastiske i sin genekspresjon 10,11,12, gjør at metoden også for identifisering av sjeldne celle populasjoner definert av sine genuttrykk profiler. Selv om denne metoden gir en rekke spennende potensielle bruker i genekspresjonsanalyse, det er Some begrensninger og hensyn i bruken av enkeltceller. Den primære begrensning til enkelt celle analyse, er samlingen av nok celler i forsøket for å oppnå statistisk signifikans med hensyn til det metriske av interesse, for eksempel varians. I tilfeller der antall celler isolert fra vev i området er ikke en begrensning, kan man undersøke hundrevis av celler per gruppe, med tilnærminger som neste generasjons sekvensering, eller nanofluidic arrays. Men i noen tilfeller kan det være problemer med å skaffe tilstrekkelig celler fra vev av interesse. Dette kan delvis være forårsaket av idiosynkratiske tidkrevende prosedyrer for innsamling av målrettede celletype. Kan imidlertid nøye planlegging og forberedelse før du fortsetter med enkelt celle kolleksjon fortsatt tillate for strenge enkelt celle analyse med begrenset teknisk feil. Når undersøke resultatene må det vurderes, at selv om denne prosedyren for å isolere cellene har vært brukt i utallige studies (inkludert mikroskopi, elektrofysiologi, etc.), kan isolasjon selv potensielt effekt genuttrykk. Som med enhver metode som manipulerer biologiske prøver, bør resultatene av dine funn nøye kontrollert for å sikre den enkelt celle uttrykket er representativ for vevet selv og ikke teknisk bias. Metoder som in situ hybridisering kan vise seg nyttig å verifisere disse resultatene i intakt vev. Endelig er det avgjørende å sikre at data generert blir nøye sjekket for kvalitetskontroll. Dataene er vist i Figur 8 viser at qPCR analyser kan være svært robust i spesifisitet sine, som for eksempel analysen # 13 (A13) eller har en høy grad av variasjon som kan føre til tekniske varians som assay # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvic Acid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobasic </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dekstrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protease, Type XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Type I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x DNA Suspension buffer (10 mM Tris, 8,0 pH, 0.1 mM EDTA) </td><td> Teknova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Pentobarbital </td><td> Henry Schein veteranen. Forsyning * </td><td> Kontakt leverandør for bestilling </td><td> * Må anskaffes gjennom en veterinær eller lab dyr profesjonelle </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Rxn Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> Hevet III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primer Mix </td><td> IDT </td><td> Custom </td><td></td></tr><tr><td> Nukleasefritt Free vann </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick PCR rensing kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop spektrofotometer </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA 7500 kit </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> Ett Color Merking kit </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k array </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Komplett Whole transkriptom Amplification Kit (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Mens mange studier har undersøkt genuttrykk endringer fra homogenates hjerte vev, hindrer dette studere iboende stokastiske variasjonen mellom celler i en vev. Isolering av rene cardiomyocyte populasjoner gjennom en collagenase perfusjon av mus hjerter forenkler generasjonen av encellede microarrays for hele transkriptom genuttrykk, eller qPCR av spesifikke mål med nanofluidic arrays. Vi beskriver her en prosedyre for å undersøke enkelt celle genuttrykk profiler av cardiomyocytes isolert fra hjertet. Dette paradigmet gir mulighet for vurdering av beregninger av interesse som ikke er avhengig av gjennomsnittet (for eksempel avvik mellom celler i en vev) som ikke er mulig ved bruk av konvensjonelle hele vev arbeidsflyter for evaluering av genuttrykk (Figur 1). Vi har oppnådd solide forsterkning av encellede transkriptom gir mikrogram dobbelt strandet cDNA som forenkler bruken av mikromatriser på individual celler. I prosedyren beskriver vi bruk av NimbleGen arrays som var valgt for sin brukervennlighet og evne til å tilpasse sine design. Alternativt kan en omvendt transkriptase - lar bestemt mål forsterkning (RT-STA) reaksjon, for qPCR hundrevis av mål med nanofluidic PCR. Ved hjelp av en av disse metodene, er det mulig å undersøke variasjonen av uttrykk mellom celler, samt undersøke uttrykket profiler av sjeldne celletyper fra et vev. Samlet sett, gir enkelt celle genuttrykk tilnærming for generering av data som potensielt kan identifisere idiosynkratiske uttrykk profiler som er typisk gjennomsnitt ut når undersøke uttrykk av millioner av celler fra typiske homogenates generert fra hele vev.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enkelt celle uttrykk profilering gir detaljerte genekspresjonsanalyse av individuelle celler. Vi beskriver metoder for isolering av cardiomyocytes, og forbereder den resulterende lysates for enten hele transkriptom microarray eller qPCR av spesifikke mål.

Enkelt Cell transcriptional Profilering av Adult Mouse cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon og kultur av Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon og fysiologiske Analyse av Muse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolasjon og kultur av voksne musen Cardiomyocytes for Cell Signaling og<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiac Hypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) som et verktøy for Transkripsjonell Profilering av individuelle celletyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon, kultur og transduksjon av Adult Mouse cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-indre cellen masse injeksjon av embryonale stamceller fører til høyere Chimerism priser

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Slippverktøy Barcoding-baserte enkelt celle Transcriptomics av voksen pattedyr vev

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Cell type-spesifikke Gene Expression profilering i musen Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolasjon, transfection, og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...