Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить признательность технической помощи С. Zambataro во время съемок этого протокола. Мы выражаем искреннюю благодарность поддержке Гленн Фонда медицинских исследований (SM), Hillblom фонд, и Национальный институт здоровья для Центра награду Ударная Натан (P30AG025708) и PO1AG025901. JMF был поддержан T32AG000266 присуждена Бак Институт исследований по проблемам старения.

<ol>
	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Свободный доступ и производство этого данной статьи является спонсором Sigma-Aldrich.</p

Этот метод имеет возможность генерировать кардиомиоциты для ряда функциональных, а также исследования экспрессии генов. Изучение отдельных клеток является растущей области в гене анализа экспрессии. Преимущество изучения транскрипционных уровней, на уровне одной клетки, что он позволяет изучить чистой популяции клеток, которые не представляется возможным из цельного тканевые препараты. Кроме того, в одном анализе клеток позволяет для изучения стохастических изменение уровня мРНК в отдельных ячейках для определения клеточных популяций, которые ранее считались однородными 8,9. В дополнение к идентификации генов, которые потенциально являются стохастические в их экспрессии генов 10,11,12, метод также позволяет идентификации редких клеточных популяций определяется их профили экспрессии генов. Хотя этот метод предоставляет ряд интересных возможностей применения в генной анализа экспрессии, Есть сомовэлектронной предостережения и аспекты использования отдельных клеток. Основное ограничение для одного анализа клетки, коллекция достаточное количество клеток в эксперименте для достижения статистической значимости по отношению к метрике интерес, например дисперсии. В случаях, когда число клеток, выделенных из тканей проценты не ограничение, можно рассмотреть сотни клеток на группы, используя подходы, такие как нового поколения, секвенирование, или nanofluidic массивов. Тем не менее, в некоторых случаях, могут быть трудности с получением достаточного клетки из тканей, представляющих интерес. Это может быть отчасти вызван своеобразный время интенсивных процедур для сбора целевых типа клеток. Тем не менее, тщательного планирования и подготовки перед продолжением одной коллекции клетка может по-прежнему позволяют строгий анализ одной ячейке с ограниченной технической ошибки. При рассмотрении результатов необходимо учитывать, что, хотя эта процедура выделения клетки были использованы в многочисленных Studieс (в том числе микроскопии, электрофизиологии и др.), изоляция сама по себе может потенциально эффект экспрессии генов. Как и любой метод, который манипулирует биологических образцов, результаты ваших выводах должны быть тщательно проверяются на обеспечение одного выражения ячейки представитель самой ткани, а не техническим уклоном. Такие методы, как на месте гибридизация может оказаться полезным для проверки этих результатов в неповрежденной ткани. Наконец, крайне важно, чтобы гарантировать, что данные, полученные тщательно проверяется на предмет контроля качества. Данные, приведенные на рисунке 8 показано, что КПЦР анализы могут быть очень надежными в их специфичности, таких как анализ # 13 (A13) или имеют высокий уровень изменчивости, которая может привести к технической дисперсии, такие как анализ # 34 (А34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Пировиноградная кислота </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 одноосновных </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Декстроза </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Протеазы, Тип XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Коллаgenase, Тип I </td><td> Уортингтон </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x ДНК Подвеска буфера (10 мМ Трис, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА) </td><td> TEKnova, </td><td> П. Н. T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Натрий пентобарбитал </td><td> Генри Шайн Vet. * Поставка </td><td> Связаться с поставщиком для заказа </td><td> * Должны быть закуплены по ветеринарии или лабораторных животных профессиональной </td></tr><tr><td> ExoSAP ИТ </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Mix Rxn </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> Надстрочный III RT Платиновый Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primer Mix </td><td> IDT </td><td> Обычай </td><td></td></tr><tr><td> Нуклеазы свободной воды </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick ПЦР-комплект очистки </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Спектрофотометр </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer ДНК 7500 комплект </td><td> Agilent </td><td> 7500 комплект </td><td></td></tr><tr><td> Один цвет маркировки комплект </td><td> Рош-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Муз мышцы 12x135k массив </td><td> Рош-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Сканер </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Полное Целое Kit Усиление транскриптома (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Хотя многочисленные исследования изучили изменения экспрессии генов из гомогенатов сердечной ткани, это препятствует изучению присущих изменение стохастической между клетками в тканях. Выделение чистой кардиомиоцитов населения посредством коллагеназы кровоснабжение сердца мышь облегчает поколение микрочипов одной ячейки для целого транскриптома экспрессии генов, или КПЦР конкретных целей с использованием nanofluidic массивов. Мы описываем здесь процедуры для изучения одной клетки профили экспрессии генов кардиомиоцитов изолированного от всего сердца. Эта парадигма позволяет оценки метрик интерес, который не зависит от среднего значения (например, разницы между клеток в ткани), что невозможно при использовании обычных целом рабочие процессы тканей для оценки экспрессии генов (рис. 1). Мы добились надежных усиление одной клетки транскриптома уступая микрограмм двухцепочечной кДНК, которая облегчает использование микрочипов на яndividual клеток. В процедуре мы описываем использование массивов NimbleGen, которые были отобраны за их простоту использования и возможность настройки их конструкции. Кроме того, обратной транскриптазы - удельный усиления цели (RT-STA) реакции, позволяет КПЦР сотни мишеней nanofluidic ПЦР. Использование любого из этих подходов, можно изучить изменчивость выражения между клетками, а также рассмотреть профили экспрессии редких типов клеток из ткани. В целом, одной клетке экспрессию генов подход позволяет поколение данных, которые потенциально могут определить своеобразный профилей выражение, которое, как правило, усредняются при рассмотрении выражения из миллионов клеток от типичных гомогенатах полученные от целого тканей.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Одноместный профилирования выражение клеток позволяет детальный анализ экспрессии генов в отдельных клетках. Мы опишем методы для выделения кардиомиоцитов, а также подготовку результате лизатов или для целого микрочипов транскриптома или КПЦР конкретных задач.

Single Cell транскрипции Профилирование взрослых кардиомиоцитов мышь

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Генерация одноклеточных суспензий от мыши нервной ткани

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Выделение и Культура неонатологическую мыши кардиомиоцитов

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Выделение и физиологический анализ мыши кардиомиоцитов

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Выделение и Культура взрослой мыши кардиомиоцитов для клеточной сигнализации и<em&gt; В пробирке</em&gt; Гипертрофия сердца

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Помощью лазера микродиссекция (LAM) в качестве инструмента для транскрипционные Профилирование отдельных типов клеток

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Изоляция, культуры и трансдукция взрослых мышей кардиомиоцитов

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Транс внутренняя ячейка массы впрыска эмбриональных стволовых клеток приводит к более высоким ставкам химеризма

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Капли на основе штриховое кодирование одну ячейку Transcriptomics взрослых тканей млекопитающих

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Сотовый тип-специфический Джин Выражение Профилирование в печени мыши

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Изоляция, трансфекция и долгосрочная культура взрослых мышей и крысиных кардиомиоцитов

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...