Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
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Los autores desean agradecer la asistencia técnica de la C. Zambataro durante el rodaje de este protocolo. Agradecemos el apoyo de la Fundación Glenn de Investigación Médica (SM), la Fundación Hillblom, y los Institutos Nacionales de Salud para el premio Centro de Nathan Shock (P30AG025708) y PO1AG025901. JMF fue apoyada por T32AG000266 otorgado al Instituto Buck de Investigación sobre el Envejecimiento.

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<p class="jove_content"&gt; Acceso Libre y la producción de este de este artículo es patrocinado por Sigma-Aldrich.</p

Este método tiene la posibilidad de generar cardiomiocitos para un número de funcionales, así como estudios de expresión génica. El examen de las células individuales es un área floreciente en el análisis de expresión génica. La ventaja de estudiar los niveles de la transcripción a nivel de la célula es que permite el examen de una población celular pura, que no es posible a partir de preparaciones de tejidos conjunto. Además, el análisis de células individuales permite el examen de la variación estocástica de los niveles de mRNA en las células individuales para definir las poblaciones de células que se creía que ser homogénea 8,9. Además de identificar los genes que son potencialmente estocástico en su expresión génica 10,11,12, el método también permite la identificación de las poblaciones celulares raras definidas por sus perfiles de expresión génica. Aunque este método ofrece una serie de interesantes aplicaciones potenciales en el análisis de expresión génica, hay somadvertencias e y consideraciones en el uso de células individuales. La principal limitación para el análisis de células individuales, es la recolección de suficientes células en el experimento para alcanzar la significación estadística en cuanto a la métrica de interés, por ejemplo, la varianza. En los casos en que el número de células aisladas de tejido de interés no es una limitación, se puede examinar cientos de células por grupo, utilizando métodos como la secuenciación de próxima generación, o matrices nanofluídicos. Sin embargo, en algunos casos, puede haber dificultades para obtener suficientes células de los tejidos de interés. Esto puede en parte ser causado por procedimientos tiempo idiosincrasia intensiva para la recolección del tipo de células específicas. Sin embargo, una cuidadosa planificación y preparación antes de proceder con la colección única célula puede todavía permitir un análisis riguroso sola célula con un error técnico limitado. Al examinar los resultados debe tenerse en cuenta, que aunque este procedimiento para aislar las células se ha utilizado en numerosas Studies (incluida la microscopía, la electrofisiología, etc), el propio aislamiento potencialmente podría afectar a la expresión génica. Al igual que con cualquier otro método que manipula las muestras biológicas, los resultados de sus hallazgos deben ser cuidadosamente validados para asegurar la expresión de células individuales es representativa del propio tejido y el sesgo de no técnicos. Métodos como la hibridación in situ puede ser útil para verificar estos resultados en el tejido intacto. Por último, es fundamental para asegurar que los datos generados es cuidadosamente revisada para el control de calidad. Los datos mostrados en la Figura 8 demuestra que los ensayos de qPCR puede ser muy fuerte en su especificidad, como el ensayo N º 13 (A13) o tener un alto nivel de variabilidad que puede llevar a la variación de técnicas, como prueba de # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido pirúvico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobásico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasa, Tipo XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Colladeshidrogenasa, Tipo I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> Suspensión de ADN 1x Buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td> Henry Schein Vet. * Fuente de </td><td> Contactar con proveedor para ordenar </td><td> * Deben ser adquiridos a través de un veterinario o un laboratorio profesional de animales </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Mix Rxn </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> Superíndice III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primer Mix </td><td> IDT </td><td> Costumbre </td><td></td></tr><tr><td> Nucleasa libre de agua </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR kit de purificación </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Espectrofotómetro </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> Bioanalyzer 7500 kit de ADN </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> Un color kit de etiquetado </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k serie </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Escáner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex completa transcriptoma enteros Kit de amplificación (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Si bien numerosos estudios han examinado los cambios de expresión génica de los homogeneizados de tejido cardíaco, lo que impide el estudio de la variación estocástica inherente entre las células en un tejido. El aislamiento de poblaciones puras de cardiomiocitos a través de una perfusión de colagenasa de los corazones del ratón facilita la generación de microarrays de células única de toda la expresión de genes transcriptoma, o qPCR de objetivos específicos con matrices nanofluídicos. Se describe aquí un procedimiento para examinar las células individuales perfiles de expresión génica de los cardiomiocitos aislados desde el corazón. Este paradigma permite la evaluación de los parámetros de interés que no dependen de la media (por ejemplo, la variación entre las células en un tejido) que no es posible cuando se utilizan los flujos de trabajo convencionales, todo el tejido para la evaluación de la expresión génica (Figura 1). Hemos logrado la amplificación de la robusto microgramos transcriptoma de células individuales rendimiento de cDNA de doble cadena que facilita el uso de microarrays de icélulas INDIVIDUALES. En el procedimiento se describe el uso de las matrices de NimbleGen, que fueron seleccionados por su facilidad de uso y capacidad de personalizar su diseño. Por otra parte, una transcriptasa inversa - amplificación específicos (RT-STA) de reacción, permite qPCR de cientos de objetivos por nanofluídicos PCR. Con cualquiera de estos métodos, es posible examinar la variabilidad de la expresión entre las células, así como examinar los perfiles de expresión de los tipos de células poco comunes dentro de un pañuelo de papel. En general, el único gen de células enfoque de expresión permite la generación de datos que potencialmente pueden identificar los perfiles de expresión peculiar que suelen promediar la hora de examinar la expresión de millones de células a partir de homogeneizados de tejidos típicos generados a partir de su conjunto.

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Perfiles de expresión de células individuales permite el análisis detallado de la expresión génica de células individuales. Se describen los métodos para el aislamiento de los cardiomiocitos, y la preparación de los lisados ​​resultantes, ya sea para toda microarrays transcriptoma o qPCR de objetivos específicos.

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