Name: single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Författarna vill tacka för det tekniska bistånd av C. Zambataro under inspelningen av detta protokoll. Vi erkänner tacksamt stöd av Glenn Stiftelsen för medicinsk forskning (SM), The Hillblom Foundation och National Institutes of Health för en Nathan Shock Center Award (P30AG025708) och PO1AG025901. JMF stöddes av T32AG000266 tilldelas Buck institutet för forskning om åldrande.

<ol>
	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Fri tillgång och produktion av denna med denna artikel är sponsrad Sigma-Aldrich.</p

Denna metod har möjlighet att generera cardiomyocytes för ett antal funktionella samt gener studier uttryck. Granskningen av enskilda celler är en spirande område i genuttryck analys. Fördelen med att undersöka transkriptionella nivåer på samma nivå som den enda cell är att det tillåter en undersökning av en ren cell befolkning, vilket inte är möjligt från hela vävnaden förberedelser. Dessutom ger en enda cell analys för granskning av stokastiska variationen av mRNA nivåer i enskilda celler att definiera cellpopulationer som tidigare ansågs vara homogen 8,9. Förutom att identifiera gener som är potentiellt stokastiska i deras genuttryck 10,11,12, kan metoden även för identifiering av sällsynta cellpopulationer definieras av sina profiler genuttryck. Även om denna metod ger ett antal spännande potentiella användningsområden i genuttryck analys, det finns SOM-e varningar och överväganden i användningen av enskilda celler. Den främsta begränsningen till enskild cell analys, är att samla in tillräckligt många celler i försöket att uppnå statistisk signifikans när det gäller det metriska av intresse, till exempel varians. I de fall där antalet celler som isolerats från vävnaden av intresse är inte en begränsning, kan man undersöka hundratals celler per grupp, med hjälp av metoder såsom nästa generations sekvensering eller nanofluidic matriser. Men i vissa fall kan det vara svårt att få tillräcklig celler från vävnaden av intresse. Detta kan delvis bero på idiosynkratiska tidsödande förfaranden för insamling av de riktade celltyp. Kan dock noggrann planering och förberedelse innan du fortsätter med en enda cell samling kan fortfarande rigorös enskild cell analys med begränsat tekniskt fel. När man granskar resultaten måste beaktas, att även om detta förfarande för att isolera celler har använts i många Studies (inklusive mikroskopi, elektrofysiologi, etc.), kan isoleringen i sig effekten potentiellt genuttryck. Som med alla metod som manipulerar biologiska prover, bör resultaten av dina fynd noga valideras för att säkerställa en enda cell uttrycket är representativt för den vävnad i sig och inte tekniska bias. Metoder såsom in situ hybridisering kan vara användbar för att verifiera dessa resultat i den intakta vävnaden. Slutligen är det viktigt att säkerställa att de data som genereras noggrant kontrolleras för kvalitetskontroll. De data som visas i figur 8 visar att qPCR tester kan vara mycket robust i sin specificitet, såsom analys # 13 (A13) eller ha en hög grad av variation som kan leda till tekniska varians som analysen # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71.378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60.128 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrodruvsyra </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54.457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 enbasiskt </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dextros </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72.068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21.115 </td><td></td></tr><tr><td> Proteas, Typ XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, typ I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x DNA Suspension buffert (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium Pentobarbital </td><td> Henry Schein Vet. Supply * </td><td> Kontakta leverantören för beställning </td><td> * Måste anskaffas genom en veterinär eller labb djur professionella </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78.201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Rxn Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> Upphöjd III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA primermix </td><td> IDT </td><td> Anpassad </td><td></td></tr><tr><td> Nukleasfritt gratis vatten </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick PCR rening kit </td><td> Qiagen </td><td> 28.104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Spektrofotometer </td><td>NanoDrop </td><td> 2000C </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA-7500 kit </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> En färg Märkning kit </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k rad </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex komplett helhet transkriptom Amplification Kit (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Medan många studier har undersökt förändringar genuttryck från homogenat av hjärtvävnad, förhindrar att studera den inneboende stokastiska variationen mellan celler i en vävnad. Isolering av ren cardiomyocyte befolkningar genom en kollagenas perfusion av mus-hjärtan underlättar generations enda cell microarrays för hela transkriptom genuttryck, eller qPCR av specifika mål med hjälp av nanofluidic matriser. Vi beskriver här ett förfarande för att undersöka en enda cell genuttrycksprofilerna av cardiomyocytes isolerade från hjärtat. Detta paradigm möjliggör utvärdering av mätetal av intresse som inte är beroende av medelvärdet (till exempel skillnader mellan celler i en vävnad) vilket inte är möjligt vid användning av konventionella hela vävnad arbetsflöden för utvärdering av genuttryck (Figur 1). Vi har uppnått stark förstärkning av den inre ger cellen transkriptom mikrogram dubbelsträngad cDNA som underlättar användningen av microarrays om jagndividual celler. I det förfarande som vi beskriver användningen av NimbleGen matriser som valdes för sin användarvänlighet och förmåga att anpassa sin design. Alternativt kan ett omvänt transkriptas - låter specifikt mål förstärkning (RT-STA) reaktion, för qPCR av hundratals mål senast nanofluidic PCR. Med någon av dessa metoder är det möjligt att undersöka variationer i uttrycket mellan celler, samt att undersöka uttryck profiler av sällsynta celltyper inifrån en vävnad. Sammantaget gör det enda cell genexpression metod för generering av data som potentiellt kan identifiera idiosynkratiska uttryck profiler som normalt genomsnitt ut när undersöka uttryck av miljontals celler från typiska homogenat genereras från hela vävnader.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enda cell expression profiling gör en detaljerad analys genuttryck av enskilda celler. Vi beskriver metoder för isolering av cardiomyocytes och förbereda den resulterande lysates för antingen hela transkriptom microarray eller qPCR av specifika mål.

Single Cell transkriptionell Profilering av Vuxen mus Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generering av encelliga Suspensioner från mus nervvävnad

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering och odling av neonatala Mus Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering och fysiologisk Analys av Mus Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolering och kultur i vuxen mus Cardiomyocytes för cellsignalering och<em&gt; In vitro</em&gt; Hjärthypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) som ett verktyg för transkriptions Profilering av enskilda celltyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolering, kultur och Transduction av vuxna möss Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-inner Cell Mass injektion av embryonala stamceller leder till högre chimärism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Droplet streckkodning-baserade enda Cell transkriptomik av vuxna däggdjur vävnader

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Celltypspecifika gen uttrycks profilering i mus levern

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolering, Transfection, och långsiktig kultur av vuxna Mus och Råtta Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...