Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Vi takker hele Sigma Life Science Mission Target ID Bibliotek udviklingsteam, især Kevin Gutshall for at finde den teknologi og forhandle licensbetingelserne, og Heather Holemon for hendes støtte og deltagelse i frugtbare fejlfinding diskussioner. Vi takker også Dr. Joop Gäken af ​​Kings College i London for fri deling af upublicerede resultater og forslag, og Qazi Hamid i RxBiosciences for at forberede en stor portion af cDNA og hans vedholdenhed i at få det klonet. Vi vil gerne anerkende Nan Lin og Scott Bahr fra SAFC til at udføre cDNA arrays og dataanalyse. Mission er et registreret varemærke tilhørende Sigma-Aldrich Bioteknologi LP

<ol>
	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li><li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desperately+seeking+microRNA+targets.">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li><li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li><li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer.">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li><li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-221+and+miR-222,+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas,+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle.">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene.">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncoding+RNA,+miR-126,+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers.">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Forfatterne erklærer finansielle forbindelser med kommercielle foretagender, der har en interesse i det indsendte arbejde.

microRNA&#39;er er 20-24 nucleotid RNA&#39;er, som regulerer genekspression efter transskriptionelt ved inhibering mRNA translation, og ofte destabilisere målrettet mRNA (gennemgået i [6]). En enkelt miRNA kan regulere flere hundrede mRNA&#39;er til at styre en celles respons på udviklingsmæssige og miljømæssige signaler. Identifikation og validering af target mRNA er afgørende ved fastsættelsen af ​​en miRNA rolle og funktion i disse veje. Imidlertid målet identifikation er ikke ligetil, fordi, i dyr, miRNA og deres målsteder er ikke fuldt komplementær. &quot;Seed&quot; region, baseret 2 til 7 fra 5&#39;-enden af ​​miRNA, sædvanligvis komplementær til dens mål. Men der er mange undtagelser fra frøet reglen, og nedstrøms base-parring kan kompensere for et ufuldkomment frø match. En række af edb-algoritmer er blevet udviklet til at forudsige miRNA mål baseret på frø matchning og nedstrøms kompensation, målstrukturen end position, sekvensbevarelse, og forskellige andre parametre, der er blevet observeret for eksperimentelt validerede targets (revideret i [7]). Mens in silico forudsigelser er bekvemme og gøre identificere mange gyldige miRNA mål, de fleste forudsagde gener ikke eksperimentelle valideringstest, og mange egentlige mål ikke forudsiges. Da computeralgoritmer er baseret på tidligere bestemte mål træk, at de ikke tillader opdagelse af mål, der afviger fra, hvad der allerede er kendt. Et antal eksperimentelle systemer er blevet anvendt med succes til at identificere eller opdage funktionelle miRNA mål i levende celler. Disse globale screeningsmetoder indbefatter mikroarrays og RNA-sekventering, RNA co-immunopræcipitation (RIP), og stabile isotop mærkning med Aminosyrer i cellekultur (SILAC), en proteomik metode (gennemgået i [7]). Hver metode har fordele og ulemper. Idet miRNA målretning ofte destabiliserer en mRNA og fører til nedbrydning, tab or gevinst i mRNA niveau efter at indføre en miRNA efterligne eller hæmmer, henholdsvis kan identificere miRNA mål. Dette tab eller forøgelse af mRNA let detekteres ved mikroarray eller dyb-sekventering. Mens mRNA detektionsmetoder er enklere og mere følsomme end protein påvisningsmetoder, vil mRNA detektion glip af miRNA mål, der ikke nedbrydes. Nylige rapporter fra Bartell laboratoriet sammenligne miRNA target resultater fra RNA detektion med dem fra SILAC [8] eller ribosom profilering [9] viser, at pattedyr miRNA overvejende virker ved at reducere target mRNA niveauer. Dog har mange andre laboratorier, der arbejder med de enkelte miRNA mål opdaget ændring i protein, men ingen ændring i mRNA niveau. Rapporter om, hvad der synes at være translationel regulering uden påviselig mRNA tab omfatter: miR-10b på HOXD10 [10], miR221/222 på p27kip1 [11], miR-21 på Pdcd4 [12], miR-126 på p85β [13] , miR-34 på SIRT1 [14], miR-21 på PTEN [15], miR-302d på Arid4b [16], miR-200c på JAG1 [17], og miR-299, 297, 567, ennd 609 på VEGFA [18]. Endvidere Clancy et al [19] nylig rapporteret, at translationel regulering af let-7 blev kun detekteres, når de individuelle mRNA isoformer, der indeholder let-7 målstedet blev detekteret selektivt. Sidstnævnte antyder, at i det mindste i nogle tilfælde kan translationel regulering overses i et sammensat profil - dvs når alle mRNA isoformer detekteres som en mRNA - som opnået med mange microarray og sekvensanalyser. Co-immunpræcipitering af miRNA-mRNA komplekser via argonaute (normalt ago2) eller et andet associeret protein (RNA immunfældning, eller UP) vil isolere miRNA mål uanset reguleringsmekanisme. Desuden detekterer RIP endogene, og formodentlig biologisk relevant, interaktioner. Imidlertid vides det ikke, om alle miRNA-mRNA interaktioner er funktionelle, og RIP vil springe nogen mRNA mål at associere kun forbigående eller hurtigt nedbrydes. Derudover skal specifikke miRNA-mRNA partnere udledes bioinformatitisk, fordi alle miRNA-mRNA par co-udfældet sammen. Endelig SILAC direkte identificerer slutproduktet miRNA regulering proteinet selv, men er ufølsom og derfor savner sjældne proteiner og små fold ændringer i protein-niveauer. I lyset af de begrænsninger med nuværende miRNA-target identifikationsmetoder, følte vi en yderligere global analyse for at identificere funktionelle miRNA mål ved en alternativ mekanisme var nødvendigt. For at opfylde dette behov, har vi licens en teknologi opfundet af Joop Gaken og Azim Mohamedali af Kings College i London. Deres opfindelse er en dobbelt selektion fusionsprotein, specifikt en thymidinkinase-zeocin fusion reguleres af et cDNA-bibliotek af potentielle miRNA målsekvenser i sin 3&#39;-UTR. Celler stabilt transfekteret med og udtrykkende TKzeo-cDNA-konstruktioner kan vælges med zeocin, som illustreret i figur 2. Efter udtryk for en miRNA af interesse, kan der miRNA målsætninger vælges with ganciclovir, som illustreret i fig 3. Ganciclovir dræber celler, der udtrykker thymidinkinase, der er eventuelle celler, der udtrykker TKzeo-cDNA mangler et mål for miRNA af interesse. Målrettet cDNA kan isoleres ved PCR-amplifikation af DNA fra celler, som overlever ganciclovir anvendelse af primere, som flankerer cDNA og PCR-produkter kan sekventeres for at identificere mål. Vi har udviklet Kings College teknologi i et nyt værktøj for global identifikation og opdagelsen af ​​funktionelle menneskelige miRNA mål - MISSION Target ID Bibliotek. Med det mål ID biblioteket, kan brugerne isolere miRNA mål ved en serie af pattedyrcellekultur transfektion og lægemiddelselektion trin. Biblioteket er omfattende, og indeholder 66-79% af menneskelige gener. De første resultater tyder på, at både tidligere opdaget, samt nye mål kan isoleres fra MISSION Target ID Bibliotek. Selv om protokollen er af en vis længde,anvendelse af mål-ID biblioteket kræver standard molekylær laboratorieteknikker - pattedyrcellekultur, transfektion, lægemiddelselektion, PCR og sekventering - og derfor bør være inden for midler til de fleste biologer. Vi foreslår, at tilstrækkelig opmærksomhed rettes mod passende eksperimentelt design, optimering af dyrkningsbetingelser, og vigtigst af alt, præ-teste hver ny celletype til at bestemme optimale medicinindhold for udvælgelse trin (kill-kurver) for at sikre succes med Target ID Bibliotek. Som med alle miRNA target identifikationsmetoder, anbefales det kraftigt, at mål identificeret ved screening af Target ID biblioteket skal valideres med en anden fremgangsmåde, såsom mikroarray, QRT-PCR, reporter-assay (dvs. luciferase), eller Western-analyse.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq ReadyMix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute Mammalian Genomisk DNA Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Cellespecifik Nucleofection kdet </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Target ID Bibliotek </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

Det Target ID Bibliotek er designet til at hjælpe med opdagelse og identifikation af microRNA (miRNA) mål. Target ID bibliotek er et plasmid-baseret genom hele cDNA-bibliotek klonet ind i 3&#39;-UTR nedstrøms fra dobbelt selektion fusionsprotein, thymidinkinase-zeocin (TKzeo). Den første runde af selektion er stabile transformanter, efterfulgt af indførelse af en miRNA af interesse, og endelig selektion for cDNA&#39;er, der indeholder miRNA mål. Udvalgte cDNA identificeres ved sekventering (se figur 1-3 for Target ID Bibliotek Workflow og detaljer). At sikre en bred dækning af det humane transkriptomet blev Target ID bibliotek cDNA&#39;er genereres via oligo-dT primer med en pulje af totalt RNA fremstillet ud fra flere humane væv og cellelinier. Resulterende cDNA i området fra 0,5 til 4 kb, med en gennemsnitlig størrelse på 1,2 kb og blev klonet ind i p3TKzeo dobbelt selektion plasmidet (se figur 4 for plasmid kort). De genmål er repræsenteret i library kan findes på Sigma-Aldrich webside. Resultaterne fra Illumina sekventering (tabel 3) viser, at biblioteket omfatter 16.922 til 21,518 unikke generne i UCSC RefGene (79%) eller 14.000 gener med 10 eller flere læser (66%).

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Det Target ID Biblioteket er et plasmid-baseret, genom-dækkende samling af klonede cDNA bruges til at identificere miRNA mål. Her har vi vise sin brug og anvendelse.

Genome-wide screen for miRNA mål ved brug af MISSION Target ID Bibliotek

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliotek Screening i pattedyrceller

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Kvantitative og Automatiseret High-throughput genom-dækkende RNAi skærme i C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesian Change-point Algoritme for genom-dækkende analyse af Diverse ChIPseq Datatyper

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Påvisning af miRNA mål i High-throughput Brug af 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genom-dækkende Kortlægning af lægemiddel-DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tværbinding af små molekyler til at isolere Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Hele genomet Oprensning af ekstrakromosomalt cirkulært DNA fra eukaryote celler

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Omfattende arbejdsgang for Genome-wide identifikation og udtryk Meta-analyse af ATL E3 Ubiquitin Ligase gen familie i Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...