Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Nous tenons à remercier toute la vie Sigma sciences cible Mission ID développement équipe de la Bibliothèque, en particulier Kevin Gutshall pour trouver la technologie et de la négociation des conditions de licence, et Heather Holemon pour son soutien et la participation à des discussions fructueuses de dépannage. Nous remercions également le Dr Joop Gäken du Kings College de Londres pour partager librement les résultats non publiés et des suggestions, et Qazi Hamid RxBiosciences pour la préparation d&#39;un lot de grande ADNc et sa persistance à l&#39;obtenir cloné. Nous tenons à remercier Nan Lin et Scott Bahr de SAFC pour effectuer des puces à ADNc et l&#39;analyse des données. MISSION est une marque déposée de Sigma-Aldrich Biotechnology LP

<ol>
	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. 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Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent des relations financières avec des entités commerciales qui ont un intérêt dans le travail présenté.

microARN sont des ARN 20-24 nucléotides qui régulent l&#39;expression génique post-transcriptionnelle par inhibition de la traduction des ARNm, et souvent, la déstabilisation de l&#39;ARNm ciblé (revue dans [6]). Un seul miARN peuvent réguler plusieurs centaines ARNm pour contrôler la réponse d&#39;une cellule à signaux développement et d&#39;environnement. Identifier et valider les ARNm cibles est essentielle pour déterminer le rôle d&#39;un miARN et de la fonction dans ces voies. Cependant, l&#39;identification des cibles n&#39;est pas simple parce que, chez les animaux, les miRNAs et de leurs sites cibles ne sont pas tout à fait complémentaire. La «graine» région, fonde 2 à 7 de l&#39;extrémité 5 &#39;du miRNA, est généralement complémentaire à ses objectifs. Cependant, il ya de nombreuses exceptions à la règle de semences, et en aval d&#39;appariement de bases peut compenser pour un match de semences imparfaite. Un certain nombre d&#39;algorithmes informatiques ont été développés pour prédire les cibles des miRNA sur la base de correspondance de semences et de compensation en aval, la structure cible d&#39;unla position d, conservation de la séquence, et divers autres paramètres qui ont été observées pour des cibles validées expérimentalement (revue dans [7]). Bien que les prédictions in silico sont pratiques et permettent d&#39;identifier de nombreuses cibles des miRNA valides, la plupart des gènes prédit échouent aux tests de validation expérimentale, et de nombreux objectifs réels ne sont pas prévues. En outre, parce que les algorithmes informatiques sont basés sur les caractéristiques cibles préalablement déterminées, elles ne permettent pas de découverte de cibles qui s&#39;écartent de ce qui est déjà connu. Un certain nombre de systèmes expérimentaux ont été utilisés avec succès pour identifier ou de découvrir des cibles des miRNA fonctionnels dans les cellules vivantes. Ces méthodes de dépistage mondiaux comprennent les microréseaux et séquençage de l&#39;ARN, l&#39;ARN co-immunoprécipitation (RIP), et l&#39;étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés en culture cellulaire (SILAC), une méthode protéomique (revue dans [7]). Chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients. Depuis miARN ciblant déstabilise souvent un ARNm et conduit à sa dégradation, la perte ogain de r dans le niveau d&#39;ARNm après l&#39;introduction d&#39;un miRNA imiter ou d&#39;un inhibiteur, respectivement, peuvent identifier les cibles des miRNA. Cette perte ou le gain de l&#39;ARNm est facilement détectée par puces à ADN ou par séquençage en profondeur. Bien que les méthodes de détection d&#39;ARNm sont plus simples et plus sensible que les méthodes de détection de protéines, de détection d&#39;ARNm va manquer les cibles des miRNA qui ne sont pas dégradées. Des rapports récents du laboratoire Bartell comparant les résultats cibles des miRNA de détection de l&#39;ARN avec ceux de SILAC [8] ou le profilage des ribosomes [9] indiquent que les miRNAs mammifères principalement agissent en réduisant les niveaux d&#39;ARNm cibles. Cependant, de nombreux autres laboratoires qui travaillent avec des objectifs individuels miARN ont détecté le changement dans la protéine, mais aucun changement dans le niveau d&#39;ARNm. Rapports de ce qui semble être régulation de la traduction sans perte ARNm détectable comprennent: miR-10b sur HOXD10 [10], miR221/222 sur p27kip1 [11], miR-21 sur Pdcd4 [12], miR-126 sur p85β [13] , miR-34 sur SIRT1 [14], miR-21 sur PTEN [15], miR-302d sur Arid4b [16], miR-200c sur JAG1 [17], et miR-299, 297, 567, une 609 sur VEGFA [18]. En outre, Clancy et al [19] a récemment rapporté que la réglementation en translation par let-7 a été détectée lorsque isoformes d&#39;ARNm individuels qui contiennent le site let-7 ont été détectés cible de manière sélective. Celui-ci suggère que, au moins dans certains cas, régulation de la traduction peut être négligé dans un profil composite - qui est, lorsque toutes les isoformes d&#39;ARNm sont détectés comme un ARNm - obtenue avec un microréseau nombreux et analyses de séquences. Co-immunoprécipitation des miARN-ARNm complexes via Argonaute (généralement Ago2) ou d&#39;une autre protéine associée (ARN immunoprécipitation, ou RIP) permet d&#39;isoler les cibles des miRNA indépendamment du mécanisme de règlement. En outre, RIP détecte endogène, et probablement biologiquement pertinente, les interactions. Cependant, on ne sait pas si toutes les interactions miARN-ARNm sont fonctionnels, et RIP serait manquer aucun ARNm cibles qui associent uniquement de façon transitoire ou sont rapidement dégradées. En outre, spécifiques miARN-ARNm des partenaires doit être déduite bioinformatiment parce que toutes les paires de miARN-ARNm co-précipités ensemble. Enfin, SILAC identifie directement le produit final de la réglementation miRNA, la protéine elle-même, mais elle est insensible et manque donc de protéines rares et de petits changements de pliage dans les taux de protéines. À la lumière des limites des méthodes actuelles d&#39;identification des miRNA cibles, nous nous sommes sentis un test global supplémentaire pour identifier les cibles des miRNA fonctionnelles par un autre mécanisme a été nécessaire. Pour répondre à ce besoin, nous sous licence une technologie inventée par Joop Gaken et Azim Mohamedali du Kings College de Londres. Leur invention est une protéine de fusion double sélection, en particulier, une thymidine kinase-zéocine fusion, régie par une banque d&#39;ADNc de séquences cibles potentielles de miARN dans son 3&#39;UTR. Les cellules transfectées de façon stable avec et exprimant TKzeo-ADNc constructions peuvent être sélectionnés avec la zéocine, comme illustré dans la figure 2. Après avoir exprimé un miRNA d&#39;intérêt, les objectifs que miARN peuvent être sélectionnés wie ganciclovir, comme l&#39;illustre la figure 3. Ganciclovir tue les cellules exprimant la thymidine kinase, qui est, toutes les cellules exprimant TKzeo-ADNc défaut une cible pour la miARN d&#39;intérêt. Ciblée d&#39;ADNc peut être isolé par amplification par PCR de l&#39;ADN à partir de cellules qui survivent au ganciclovir en utilisant des amorces qui flanquent les produits d&#39;ADNc et la PCR peut être séquencés pour identifier les cibles. Nous avons développé une technologie Collège du Roi dans un nouvel outil pour l&#39;identification globale et la découverte de cibles fonctionnelles miRNA humains - la Bibliothèque ID MISSION cible. Avec la Bibliothèque ID cible, les utilisateurs peuvent isoler des cibles des miRNA par une série de transfection de culture cellulaire de mammifère et des mesures de sélection des médicaments. La bibliothèque est complète, et contient 66-79% des gènes humains. Les premiers résultats indiquent que les deux précédemment découvert ainsi que de nouvelles cibles peuvent être isolés de la Bibliothèque ID MISSION cible. Bien que le protocole est d&#39;une certaine longueur,l&#39;utilisation de la Bibliothèque ID cible nécessite des techniques standard de laboratoire moléculaires - culture cellulaire de mammifère, la transfection, la sélection des médicaments, la PCR et le séquençage - et, par conséquent, devraient être bien dans les moyens de la plupart des biologistes. Nous suggérons qu&#39;une attention suffisante soit accordée à la conception expérimentale proprement dite, l&#39;optimisation des conditions de culture, et surtout, de pré-tester chaque nouveau type de cellule pour déterminer les niveaux de médicaments optimales pour les étapes de sélection (kill-courbes) pour assurer le succès avec la Bibliothèque ID cible. Comme avec les méthodes d&#39;identification des miRNA tous les cibles, il est fortement recommandé que les objectifs identifiés par criblage de la bibliothèque ID cible être validée par une deuxième méthode, tels que puces, qRT-PCR, test rapporteur (c.-à-luciférase), ou l&#39;analyse de l&#39;Ouest.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Le ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute ADN génomique des mammifères Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> K nucléofection Cell Specificil </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zéocine </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> ID cible Bibliothèque </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

La Bibliothèque ID cible est conçu pour aider à la découverte des cibles et l&#39;identification des microARN (miARN). La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l&#39;échelle du génome ADNc cloné dans les 3&#39;UTR aval de la protéine de fusion à double sélection, la thymidine kinase-zéocine (TKzeo). Le premier tour de sélection est pour les transformants stables, suivie avec l&#39;introduction d&#39;un miRNA d&#39;intérêt, et enfin, la sélection pour les ADNc contenant la cible du miRNA de. ADNc sélectionnés sont identifiés par séquençage (voir la figure 1-3 pour Workflow Library ID cible et les détails). Pour assurer une large couverture du transcriptome humain, ID cible Bibliothèque ADNc ont été générés via oligo-dT amorçage utilisant un pool d&#39;ARN total préparé à partir de plusieurs tissus humains et des lignées cellulaires. Résultant gamme d&#39;ADNc de 0,5 à 4 ko, avec une taille moyenne de 1,2 kb, et ont été clonés dans le p3TKzeo double plasmide de sélection (voir la figure 4 pour une carte de plasmide). Les gènes cibles représentées dans le lithèque peut être trouvée sur la page web de Sigma-Aldrich. Les résultats de séquençage Illumina (tableau 3), montrent que la bibliothèque comprend 16 922 des 21,518 gènes uniques dans UCSC RefGene (79%), ou 14.000 gènes avec 10 ou plus de lectures (66%).

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Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l&#39;échelle du génome de collecte de l&#39;ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l&#39;application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

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