Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
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Wir danken der gesamten Sigma Life Science Mission Ziel-ID-Bibliothek Entwickler-Team, vor allem Kevin Gutshall für das Finden der Technologie und Verhandlung von Lizenz-und Vertragsbedingungen und Heather Holemon für ihre Unterstützung und Teilnahme an fruchtbaren Diskussionen zur Fehlerbehebung. Wir danken auch Dr. Joop Gäken von King &#39;s College London für den Austausch frei unveröffentlichte Ergebnisse und Anregungen, und Qazi Hamid von RxBiosciences zur Herstellung einer großen Charge von cDNA und seine Beharrlichkeit in immer es geklont. Wir möchten Nan Lin und Scott Bahr aus SAFC anerkennen, zur Durchführung von cDNA-Arrays und Datenanalyse. MISSION ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sigma-Aldrich Biotechnology LP

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	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. 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Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Autoren erklären, finanziellen Beziehungen zu Wirtschaftsunternehmen, die ein Interesse an der eingereichten Arbeit zu haben.

Mikro-RNAs sind 20-24 nt-RNAs die Genexpression regulieren posttranskriptional durch die Hemmung der mRNA-Translation und häufig, gezielte Destabilisierung der mRNA (Übersicht in [6]). Ein einzelner miRNA können regeln, mehrere hundert mRNAs einer Zelle Reaktion auf entwicklungs-und umweltpolitischen Signale steuern. Ermittlung und Validierung von Ziel-mRNAs ist von wesentlicher Bedeutung bei der Bestimmung einer miRNA die Rolle und Funktion in dieser Signalwege. Allerdings ist der Target-Identifizierung nicht einfach, weil, bei Tieren, miRNAs und deren Ziel-Seiten sind nicht vollständig komplementär. Der &quot;Seed&quot;-Region, Basen 2 bis 7 aus dem 5&#39;-Ende der miRNA, ist in der Regel komplementär zu seinen Zielen. Allerdings gibt es viele Ausnahmen von der Regel Saatgut, und nachgelagerten Basenpaarung kann für eine unvollkommene Samen Match auszugleichen. Eine Reihe von Computer-Algorithmen wurden entwickelt, um miRNA-Targets auf Seed-Matching-und nachgelagerten Ausgleich, Zielstruktur basiert prognostizieren eind Position, Sequenzkonservierung, und verschiedene andere Parameter, die für experimentell validierten Targets (Übersicht in [7]) beobachtet wurden. Während in silico Vorhersagen bequem sind und nicht identifizieren viele gültige miRNA-Targets, die meisten Gene vorhergesagt ausfallen experimentelle Validierung Tests und vielen tatsächlichen Ziele sind nicht vorhersehbar. Da außerdem Computer-Algorithmen auf vorher bestimmten Ziel-Funktionen basieren, erlauben sie nicht Entdeckung von Zielen, die von dem, was bereits bekannt abweichen. Eine Reihe von experimentellen Systemen wurden erfolgreich zu identifizieren oder zu entdecken funktionelle miRNA-Targets in lebenden Zellen eingesetzt. Diese globalen Screening-Methoden gehören Microarrays und RNA-Sequenzierung, RNA-Co-Immunopräzipitation (RIP) und Markierung mit stabilen Isotopen mit den Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC), eine Proteomik-Verfahren (Übersicht in [7]). Jede Methode hat Vor-und Nachteile. Da miRNA-Targeting oft destabilisiert eine mRNA und führt zu dessen Abbau, Verlust or Gewinn an mRNA-Ebene nach der Vorstellung eines miRNA imitieren oder Inhibitor bzw. identifizieren können miRNA-Targets. Dieser Verlust oder Gewinn von mRNA wird leicht durch Microarray-oder tief-Sequenzierung nachgewiesen. Während mRNA Nachweismethoden einfacher und empfindlicher als Protein Nachweismethoden sind, wird mRNA-Nachweis verpassen keine miRNA-Targets, die nicht abgebaut werden. Jüngste Berichte aus dem Labor Bartell Vergleich miRNA Ziel ergibt sich aus RNA-Detektion mit denen aus SILAC [8] oder Ribosomen-Profiling [9] zeigen, dass miRNAs Säugetieren überwiegend durch Reduzierung Ziel-mRNA-Spiegel handeln. Allerdings haben viele andere Labore arbeiten mit einzelnen miRNA Targets Änderung Protein aber keine Änderung in der mRNA-Ebene nachgewiesen werden. Berichte von dem, was offenbar translationale Regulation ohne nachweisbare mRNA-Verlust sind: miR-10b auf HOXD10 [10], miR221/222 auf p27kip1 [11], miR-21 auf Pdcd4 [12], miR-126 auf p85β [13] , miR-34 auf SIRT1 [14], miR-21 auf PTEN [15], miR-302d auf Arid4b [16], miR-200c auf JAG1 [17], und miR-299, 297, 567, einemND 609 auf VEGFA [18]. Darüber hinaus Clancy et al [19] berichtete kürzlich, dass translationale Regulation von let-7 wurde nur erkannt, wenn einzelne mRNA-Isoformen, die die let-7-Ziel-Site enthalten, selektiv detektiert wurden. Letztere legt nahe, dass, zumindest in einigen Fällen, translationale Regulation in einem Verbundprofil übersehen werden - das heißt, wenn alle mRNA-Isoformen als eine mRNA nachgewiesen werden - wie bei vielen Mikroarray und Sequenzanalysen erhalten. Co-Immunpräzipitation von miRNA-mRNA-Komplexe über Argonaut (in der Regel Ago2) oder einem anderen assoziierten Protein (RNA Immunpräzipitation, oder RIP) wird unabhängig von miRNA-Targets Regulationsmechanismus zu isolieren. Darüber hinaus erkennt RIP endogenen und vermutlich biologisch relevante Wechselwirkungen. Es ist jedoch nicht bekannt, ob alle miRNA-mRNA Interaktionen funktionsfähig sind, und würde keine RIP-mRNA-Ziele, die nur vorübergehend zu verbinden oder auch schnell abgebaut zu verpassen. Darüber hinaus müssen spezifische miRNA-mRNA-Partnern geschlossen werden bioinformatitisch, weil alle miRNA-mRNA-Paare kogefällten zusammen. Schließlich SILAC direkt identifiziert das Endprodukt der miRNA-Verordnung, das Protein selbst, ist aber unempfindlich und daher verfehlt selten Proteinen und kleinen Falte Veränderungen im Protein-Spiegel. Vor dem Hintergrund der aktuellen Einschränkungen mit miRNA Target-Identifizierung Methoden, fühlten wir uns eine zusätzliche globale Test auf funktionelle miRNA Targets durch einen alternativen Mechanismus identifizieren, benötigt wurde. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, lizenziert wir eine Technologie, die von Joop Gaken und Azim Mohamedali von King &#39;s College London erfunden. Die Erfindung ist ein Dual-Auswahl-Fusionsprotein, insbesondere ein Thymidinkinase-Zeocin-Fusion, reguliert von einem cDNA-Bibliothek potentieller miRNA-Zielsequenzen in der 3&#39;UTR. Zellen, die stabil mit und exprimieren TKzeo-cDNA transfiziert mit Zeocin ausgewählt werden, wie in 2 dargestellt. Nach dem Ausdruck einer miRNA von Interesse, kann, dass miRNA-Ziele ausgewählt werden, with Ganciclovir, wie in Abb. 3 dargestellt. Ganciclovir tötet Zellen, die Thymidinkinase, das heißt, alle Zellen wird TKzeo-cDNA exprimieren, fehlt ein Ziel für die miRNA von Interesse. Gezielte cDNA durch PCR-Amplifikation von DNA aus Zellen, die Ganciclovir unter Verwendung von Primern, die Flanke der cDNA, PCR-Produkte sequenziert und zur Identifizierung von Zielen kann überleben isoliert werden. Missionsziel ID-Bibliothek - Wir haben die King &#39;s College-Technologie in ein neues Tool für die globale Identifikation und Entdeckung der funktionellen humanen miRNA-Targets entwickelt. Mit dem Ziel-ID-Bibliothek kann der Benutzer Zieltranskripte durch eine Reihe von Säugerzellen Transfektion und Arzneimittelselektion Schritte zu isolieren. Die Bibliothek ist umfangreich und enthält 66-79% der menschlichen Gene. Erste Ergebnisse zeigen, dass beide zuvor entdeckt sowie neue Ziele können von der Mission Ziel-ID-Bibliothek isoliert werden. Obwohl das Protokoll ist von einiger Länge,Nutzung der Ziel-ID-Bibliothek erfordert Standard molekulargenetische Labor Techniken - Säugetier-Zellkultur, Transfektion, Medikamentenauswahl, PCR, Sequenzierung und - und sollte daher gut sein, im Rahmen der Möglichkeiten der meisten Biologen. Wir vermuten, dass genügend Aufmerksamkeit, um die ordnungsgemäße experimentelles Design bezahlt werden, die Optimierung der Kulturbedingungen, und am wichtigsten, Pre-Test jedes einzelnen neuen Zelltyp, um eine optimale Wirkstoffspiegel zur Auswahl Schritte (kill-Kurven), um Erfolg mit der Ziel-ID-Bibliothek gewährleisten zu bestimmen. Wie bei allen Ziel-miRNA-Identifikations-Methoden, ist es sehr empfehlenswert, dass die Ziele durch Screening der Ziel-ID identifiziert Bibliothek mit einer zweiten Methode, wie Microarray, qRT-PCR, Reporter-Assay (dh Luciferase) oder Western-Analyse bestätigt werden.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq ReadyMix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> TOPO TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute genomische Säuger-DNA-Miniprep-Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Zellspezifische Nucleofection kes </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Ziel-ID-Bibliothek </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

Die Ziel-ID-Bibliothek wurde entwickelt, um zur Entdeckung und Identifizierung von microRNA (miRNA)-Ziele zu unterstützen. Die Ziel-ID-Bibliothek ist ein Plasmid-basierte, genomweiten cDNA-Bibliothek in der 3&#39;UTR hinter der Dual-Auswahl-Fusionsprotein, Thymidinkinase-Zeocin (TKzeo) kloniert. Die erste Runde der Wahl ist für eine stabile Transformanten, gefolgt mit Einführung einer miRNA von Interesse, und schließlich die Auswahl für die cDNAs mit der miRNA-Ziel. Ausgewählte cDNAs werden durch Sequenzierung (siehe Abbildung 1-3 für die Ziel-ID-Bibliothek und Workflow-Details) identifiziert. Um eine breite Abdeckung des menschlichen Transkriptom zu gewährleisten, wurden Ziel-ID-Bibliothek cDNAs über Oligo-dT-Priming mit einem Pool von Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben und Zelllinien hergestellt generiert. Die resultierende cDNA Bereich von 0,5 bis 4 kb, mit einer durchschnittlichen Größe von 1,2 kb, und wurden in die p3TKzeo Dual-Auswahl Plasmid kloniert (siehe 4 für Plasmid-Karte). Die Gen-Targets in der Li vertretenthek kann auf der Sigma-Aldrich Webseite. Ergebnisse von Illumina Sequenzierung (Tabelle 3) zeigen, dass die Bibliothek 16.922 der 21.518 Gene, die in einzigartiger UCSC RefGene (79%) oder 14.000 Genen, die mit 10 oder mehr liest (66%) enthält.

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Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Die Ziel-ID-Bibliothek ist ein Plasmid-basierte, Genom-weiten Sammlung von klonierten cDNA verwendet werden, um miRNA-Targets zu identifizieren. Hier zeigen wir, ihre Nutzung und Anwendung.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

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