Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
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私たちは彼女のサポートと有益なトラブルシューティングの議論に参加するため、特に全体のシグマライフサイエンスミッションのターゲットIDライブラリの開発チームは、技術を発見し、ライセンス条件を交渉するためのケビンGutshallと、ヘザーHolemonに感謝します。我々はまた、自由にそれがクローニングされ得ることに大きなcDNAのバッチとその持続性を準備するために未発表の結果と提案、RxBiosciencesのQaziハミドを共有するためにロンドン大学キングスカレッジの博士ヨープGäkenに感謝します。我々は、cDNA配列とデータ解析を行うためのSAFCからナン·リンスコット·バハルに感謝します。 ミッションは、シグマアルドリッチバイオテクノロジーLPの登録商標です。

<ol>
	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. 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Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

作者は、提出された作品に関心を持っている営利団体と金銭的関係を宣言します。

マイクロRNAは、mRNAの翻訳を阻害することにより転写後に遺伝子発現を調節すると、頻繁に、標的mRNAを（[6]日）不安定に20から24ヌクレオチドのRNAである。単一のmiRNAは、開発と環境シグナルに対する細胞の応答を制御するために数百のmRNAを調節することができます。標的mRNAを識別し、検証することで、これらの経路におけるmiRNAの役割と機能を決定する上で不可欠である。動物のmiRNAとその標的部位に完全に相補的ではありませんが、しかし、ターゲットの同定は簡単ではありません。 &quot;シード&quot;領域は、miRNAの5 &#39;末端から2〜7を基づいており、通常、そのターゲットに相補的である。しかし、そこに種子のルールには多くの例外があり、塩基対下流には、不完全種子の一致を補正することができます。コンピュータアルゴリズムの数は、シード·マッチングと下流の補償、ターゲット構造に基づいてmiRNAのターゲットを予測するために開発されているDポジション、シーケンスの保全、実験的に検証ターゲット（[7]で検討）のために観察されている他のさまざまなパラメータを設定します。インシリコ予測に便利であると識別多くの有効なmiRNAのターゲットを実行しながら、ほとんどの遺伝子は実験的な検証テストに失敗すると予測し、多くの実際の目標は、予測されていません。コンピュータのアルゴリズムは以前に決定され、ターゲットの機能に基づいているためさらに、彼らは既に知られているものから逸脱してターゲットの検出を許可しません。 実験的なシステムの数が生きている細胞内で機能的なmiRNAのターゲットを識別または発見するために首尾よく使用されています。これらのグローバルなスクリーニング法は、マイクロアレイとRNA配列、RNAの共免疫沈降法（RIP）、および細胞培養におけるアミノ酸と安定同位体標識（SILAC）、プロテオミクスの方法（[7]件）が含まれています。各メソッドには、長所と短所があります。標的miRNAはしばしばmRNAを不安定化し、その劣化、損失oにつながるので、それぞれのmiRNAを模倣または阻害剤を導入した後、mRNAレベルでのRゲインは、miRNAのターゲットを識別することができます。 mRNAのこの損失または利得を容易にマイクロアレイまたはディープシークエンシングにより検出されます。 mRNAの検出方法が簡素化され、タンパク質の検出法よりも高感度であるが、mRNAの検出が劣化しない任意のmiRNAのターゲットを欠場する。 SILACからのもの[8]またはリボソームプロファイリングでのRNA検出からmiRNAのターゲットの結果を比較するバーテルラボからの最近のレポート[9]は、哺乳動物のmiRNAが主にターゲットのmRNAレベルを減少させることによって行動することを示しています。ただし、個々のmiRNAのターゲットでの作業、他の多くのラボでは、蛋白質の変化がmRNAレベルの変化なしを検出した。検出可能なmRNAの損失と翻訳調節と思われるものの報告は、次のとおりです。のmiR-10bがPDCD4でHOXD10 [10]、p27kip1にmiR221/222 [11]、miR-21のp85β[13] [12]は、miR-126を、SIRT1上でのmiR-34 [14] PTEN [15]、のmiR - 中継台Arid4bの[16]は、miR-200C JAG1の[17]、およびmiR-299、297、567、上に、miR-21のVEGFA上のND 609 [18]。また、クランシーら[19]最近のlet - 7の標的部位を含む個々のmRNAアイソフォームが選択的に検出されたときにlet-7による翻訳調節にのみ検出されたことを報告した。すべてのmRNAアイソフォームが1つのmRNAとして検出されたときにそれがある - - として多くのマイクロアレイおよび塩基配列の解析で得られた後者は、少なくともいくつかのケースでは、並進規制が複合プロファイルに見落とされる可能性があることを示唆している。アルゴノート（通常は新生血管傷害）または他の関連タンパク質（RNA免疫沈降、またはRIP）を介してのmiRNA-mRNAの複合体の共免疫沈降に関係なく、調節機構のmiRNAターゲットを分離します。さらに、RIPは、相互作用を内在し、おそらく生物学的に関連が検出されます。しかし、それはすべてのmiRNA-mRNAの相互作用が機能的であり、RIPだけ一時的に関連付けたり、急速に劣化しているすべてのmRNAターゲットを逃すかどうかは知られていない。さらに、特異的なmiRNA-mRNAのパートナーはbioinformatiを推測する必要がありますすべてのmiRNA-mRNAのペアが一緒に共沈自動的ので。最後に、SILACは直接miRNAの調節、タンパク質自体の最終的な製品を識別しますが、小文字は区別されませんので、希少なタンパク質とタンパク質レベルの小さな倍の変化を蹴る。 現在のmiRNAのターゲット同定法の制限の光の中で、我々は別のメカニズムによって機能的なmiRNAのターゲットを識別するための追加のグローバルアッセイが必要になったと感じました。このニーズを満たすために、我々は、ヨープGakenとロンドン大学キングスカレッジのアジムMohamedaliによって発明された技術をライセンスされています。彼らの発明は、二重の選択融合タンパク質であり、具体的には、チミジンキナーゼゼオシン融合、その3&#39;UTRにおける潜在的なmiRNAの標的配列のcDNAライブラリーで規制。 図2に示すように安定TKzeo-cDNA構築物でトランスフェクトした細胞と発現しているが、ゼオシンで選択することができます。興味のあるmiRNAを発現した後、そのmiRNAのの目標は、wiを選択することができます図3に示すように、ガンシクロビル番目。ガンシクロビルは、任意の細胞が関心のmiRNAのターゲットを欠いているTKzeo-cDNAを発現しているチミジンキナーゼを発現する細胞を殺す。標的cDNAは脇腹cDNAおよびPCR産物はターゲットを識別するために配列決定することができますガンシクロビルを使用してプライマーを生き残る細胞からのDNAのPCR増幅により単離することができる。 ミッションのターゲットIDライブラリ - 我々は機能的なヒトmiRNAターゲットのグローバルな識別と発見のための新しいツールにキングス·カレッジ·テクノロジを開発しました。ターゲットIDのライブラリを使用すると、ユーザーは、哺乳動物細胞培養、トランスフェクションと薬剤選択の一連の手順によってmiRNAのターゲットを特定することができます。ライブラリは、包括的であり、ヒト遺伝子の66から79パーセントが含まれています。初期の結果は、両方の前に発見されたほか、新たな目標は、ミッションのターゲットIDライブラリから単離することができることを示しています。 プロトコルは、いくつかの長さですが、哺乳動物細胞培養、トランスフェクション、薬剤選択、PCRおよびシークエンシング - - ターゲットIDのライブラリの使用は標準的な分子生物学研究室の技術を必要とするため、ほとんどの生物学者の手段の範囲内でなければなりません。我々は十分な注意が培養条件を最適化し、適切な実験デザインに支払われ、そして最も重要なのは、ターゲットIDのライブラリと成功を確実にするための選択の手順を実行する（kill-曲線）に最適な薬物濃度を決定するために、各セルの新しいタイプを事前にテストされることを示唆している。 すべてのmiRNAのターゲットの識別方法と同様に、それは非常にターゲットIDのライブラリーをスクリーニングすることによって識別されるターゲットは、マイクロアレイ、定量RT-PCR、レポーターアッセイ（すなわち、ルシフェラーゼ）、またはウェスタン分析などの二番目の方法、使用して検証することをお勧めします。

<table border="1" ><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> JumpStartのREDTaq ReadyMix </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td>ガンシクロビル</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> TOPO TA </td><td>インビトロジェン</td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td>哺乳類のゲノムDNA MiniprepキットをGenElute </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td>細胞特異的ヌクレオのkそれ</td><td>ロンザ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のNucleofector </td><td>ロンザ</td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td>ゼオシン</td><td>インビトロジェン</td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1">ターゲットidライブラリ</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

ターゲットIDのライブラリは、マイクロRNA（miRNA）のターゲットの検出と識別を支援するために設計されています。ターゲットIDのライブラリは、デュアル選択融合タンパク質を、チミジンキナーゼ-ゼオシン（TKzeo）から3&#39;UTRの下流にクローニングしたプラスミドベースのゲノムワイドなcDNAライブラリーです。選択範囲の最初のラウンドは、安定な形質転換のために興味のあるmiRNAの導入に続いて、最後には、miRNAのターゲットを含むcDNAの選択です。選択されたcDNAは、シークエンシング（ターゲットIDライブラリワークフローと詳細については、図1-3を参照）によって識別されます。 人間のトランスクリプトームの広範なカバレッジを確保するために、ターゲットIDライブラリのcDNAは、複数のヒト組織および細胞株から調製したtotal RNAのプールを使用して、オリゴdTプライミングを経由して生成されました。 1.2キロバイトの平均サイズは、0.5〜4 kbまでのcDNAの範囲を、その結果と（プラスミドマップの図4を参照）p3TKzeoデュアル選択プラスミドにクローニングした。のLiで表される遺伝子標的braryはSigma-AldrichのWebページに記載されています。イルミナシーケンス（ 表3）、の結果から、ライブラリがUCSC RefGeneで21518ユニークな遺伝子の16922（79％）、10または読み出し以上（66％）と14,000の遺伝子が含まれていることを示しています。

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Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

ターゲットIDのライブラリは、miRNAのターゲットを識別するために使用されるクローニングされたcDNAのプラスミドベースのゲノムワイドなコレクションです。ここでは、その使用してアプリケーションを示しています。

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

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Research

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Biology

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