Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
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우리는 그녀의 지원과 결실 문제 해결 논의에 참여하기 위해 전체 시그마 생명 과학 미션 대상 아이디 라이브러리 개발팀, 특히 기술을 발견하고 라이센스 조항을 협상에 대한 케빈 Gutshall 및 헤더 Holemon 감사드립니다. 우리는 또한 자유롭게 그것이 복제지고에 큰 cDNA의 배치와 그의 지속성을 준비를 위해 게시되지 않은 결과 제안 및 RxBiosciences의 Qazi 하미드을 공유 킹스 칼리지 런던의 박사 줍 Gäken 감사드립니다. 우리는 cDNA 배열과 데이터 분석을 수행하기 위해 SAFC에서 할머니 린 스콧 Bahr을 인정하고 싶습니다. 목표는 시그마 - 올드 리치 생명 공학 LP의 등록 상표입니다

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	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. 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Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

저자는 제출한 작품에 관심을 가지고 상업적 주체와 재정 관계를 선언합니다.

microRNAs는 억제 mRNA의 번역에 의해 사후 transcriptionally 유전자 발현을 조절하고, 자주, 타겟 mRNA를 ([6]에서 검토) 약화 20-24 염기 RNAs 있습니다. 단일 miRNA는 개발과 환경 신호에 대한 세포의 반응을 제어하기 위해 수백 mRNAs을 조절할 수 있습니다. 식별 및 대상 mRNAs을 확인하면 해당 경로에서 miRNA의 역할과 기능을 결정하는 것이 필수적입니다. 동물에 miRNAs과 타겟 사이트가 완전히 보완하지 않습니다, 때문에, 표적 식별은 간단하지 않습니다. &quot;종자&quot;지역, miRNA의 5&#39; 엔드에서 7을 통해 2 기준으로, 보통의 목표를 보완합니다. 그러나 거기에 씨앗 규칙에 여러 예외이며,베이스 - 페어링 하류는 불완전한 씨앗 경기 보정할 수 있습니다. 컴퓨터 알고리즘의 숫자는 종자 매칭 및 다운 스트림 보상, 대상 구조를 기반 miRNA 목표를 예측하기 위해 개발되었습니다D 위치, 순서 보존, 그리고 실험적으로 검증 대상 ([7]에서 검토)에 대한 관찰되어 여러 가지 다른 매개 변수. 예측이 편리하고 식별 많은 유효 miRNA 목표를 silico에있는 동안 대부분의 유전자는 실험적인 검증 테스트에 실패, 많은 실제 대상이 예측되지 않는 예측했다. 컴퓨터 알고리즘은 이전에 결정된 목표 기능을 기반으로하고 있기 때문에 또한, 그들은 이미 잘 알려져 있습니다 무엇 이탈 표적의 발견을 허용하지 않습니다. 실험 시스템의 숫자는 살아있는 세포의 기능적인 miRNA 목표를 식별하거나 발견하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 글로벌 심사 방법은 microarrays와 RNA 시퀀싱, RNA 공동 immunoprecipitation (RIP) 및 세포 배양에서 아미노산과 안정 동위 원소 라벨링 (SILAC), proteomic 방법 ([7]에서 검토)가 있습니다. 각 방법은 장점과 단점이 있습니다. 타겟팅 miRNA는 종종 mRNA를 destabilizes과 열화, 분실 O로 연결하기 때문에miRNA는 각각 모방하거나 억제제를 도입 후 mRN​​A 수준에서 R 게인은 miRNA 목표를 식별할 수 있습니다. mRNA의이 손실이나 이득은 쉽게 microarray 또는 크게 시퀀싱에 의해 감지된다. mRNA 검출 방법은 간단하고 단백질 검출 방법보다 더 민감한 반면, mRNA 탐지가 타락되지 않은 miRNA 목표를 놓칠 것이다. SILAC에서 이들과 함께 RNA 검출에서 miRNA 목표 결과를 비교 Bartell 연구소의 최근 보고서 [8] 또는 ribosome 파일링 [9] 포유 동물 miRNAs는 주로 타겟 mRNA 수준을 줄임으로써 행동을 나타냅니다. 그러나 개별 miRNA 목표와 협력 많은 다른 연구진이 단백질의 변화하지만 mRNA 수준에는 변화를 감지했습니다. 노 감지 mRNA의 손실과 translational 규제하는 것으로 보이는 보고서는 다음과 같습니다 미르-10B HOXD10에 [10] p27kip1에서 miR221/222 [11] Pd​​cd4에서 미르-21 [12] 미르-126 p85β에 [13] , SIRT1의 미르-34 [14] PTEN [15] 미르-302d Arid4b에 [16] 미르-200c JAG1에 [17], 그리고 미르-299, 297, 567,에, 미르-21VEGFA에 ND 609 [18]. 또한, 클랜 외 [19] 최근 가주-7 대상 사이트를 포함하는 각각의 mRNA의 isoforms이 선택적으로 발견되었을 때 가주-7에 의해 translational 규제에만 발견되었다고 보도했다. 모든 mRNA의 isoforms 하나의 mRNA로 감지되면 그것은, -로 - 많은 microarray 및 시퀀스 분석으로 얻은 후자는 최소한 어떤 경우에는, translational 규제가​​ 복합 프로파일에 간과할 수있다,하는 것이 좋습니다. argonaute (보통 ago2) 또는 다른 관련된 단백질 (RNA immunoprecipitation, 또는 RIP)를 통해 miRNA-mRNA의 단지의 공동 immunoprecipitation에 관계없이 규제 메커니즘의 miRNA 목표를 분리합니다. 또한, RIP는 상호 작용을 내생, 그리고 아마도 생물학적으로 관련성이 감지합니다. 그러나, 그것은 모든 miRNA-mRNA의 상호 작용 기능이며, RIP 만 transiently 연결하거나 급속하게 저하에있다는 mRNA 목표를 놓칠 것인 지 알 수 없습니다. 또한, 특정 miRNA-mRNA 파트너는 bioinformati에게 유추되어야합니다모든 miRNA-mRNA 쌍 함께 공동 시켰던 캘리 때문입니다. 마지막으로, SILAC 직접 miRNA 조절, 단백질 자체의 최종 제품을 식별하지만, 구별이므로 희귀 단백질 및 단백질 수준의 작은 배 변화를 그리워합니다. 현재 miRNA 목표 식별 방법과 한계에 비추어, 우리는 다른 메커니즘에 의해 기능적인 miRNA 목표를 식별하기위한 추가적인 글로벌 분석이 필요했다 느꼈다. 이러한 필요성을 충족하기 위해 줍 Gaken와 킹스 칼리지 런던의 Azim Mohamedali에 의해 발명 기술을 허가. 그들의 발명은 이중 선택 융합 단백질이며, 특히, thymidine 키나제-zeocin 융합, 그 3&#39;UTR의 잠재적인 miRNA 목표 시퀀스의 cDNA 라이브러리에 의해 규제. 그림 2에서 그림과 같이 안정적으로 TKzeo-cDNA 구조와 함께 표현 transfected 세포는 zeocin으로 선택할 수 있습니다. 관심 miRNA을 표현하면, 그 miRNA의 목표 이래 선택할 수 있습니다일 ganciclovir와 같은 그림 3 그림. Ganciclovir는 모든 세포의 관심 miRNA에 대한 목표를 부족한 TKzeo-cDNA 표출하는 thymidine의 키나제를 표현하는 세포를 죽이는. 타겟 cDNA는 측면 cDNA와 PCR 제품은 목표를 식별하기 위해 순서가 수 ganciclovir 사용 primers를 생존 세포에서 DNA의 PCR 증폭에 의해 격리 수 있습니다. 선교 대상 아이디 도서관 - 저희 기능성 인간 miRNA 목표의 글로벌 식별 및 검색을위한 새로운 도구에 국왕의 대학 기술을 개발했습니다. 대상 아이디 라이브러리를 통해 사용자는 포유 동물 세포 배양 transfection과 약물 선택 일련의 단계에 의해 miRNA 목표를 분리할 수 있습니다. 도서관은 포괄적이며, 인간 유전자의 66-79%가 포함되어 있습니다. 초기 결과는 모두 이전에 발견뿐만 아니라 새로운 목표는 선교 대상 ID를 도서관에서 격리 수 있음을 나타냅니다. 프로토콜은 몇 가지 길이 있지만포유 동물 세포 배양, transfection, 약물 선택, PCR 및 시퀀싱 - - 타겟 ID 라이브러리의 사용은 표준 분자 실험 기법을 필요로하므로, 대부분의 생물학 자의 수단 내에서 잘해야합니다. 우리는 충분한주의가 문화 환경을 최적화, 적절한 실험 설계에 납부하고, 가장 중요한 목표 아이디 라이브러리 성공을 보장하는 선택 단계 (죽이기-커브)에 대한 최적의 약물 수준을 결정하기 위해 각각의 새로운 세포 유형을 미리 테스트하는 것이 좋습니다. 모든 miRNA 목표 식별 방법과 마찬가지로, 그것은 높은 대상 아이디 도서관을 분석해 식별 대상이 같은 microarray, qRT-PCR, 기자 분석 (즉, 루시페라제) 또는 서양 분석과 같은 두 번째 방법과 함께 확인하는 것이 좋습니다.

<table border="1" ><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Jumpstart를 REDTaq ReadyMix </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> 포유류의 게놈 DNA를 Miniprep 키트 GenElute </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 특정 Nucleofection의 K그것 </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> 대상 ID를 도서관 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

대상 아이디 라이브러리는 microRNA의 발견 및 식별 (miRNA) 목표를 지원하도록 설계되었습니다. 대상 아이디 도서관은 이중 선택 융합 단백질, thymidine 키나제-zeocin (TKzeo)에서 3&#39;UTR의 하류에 복제된 플라스미드 기반의 게놈 전체 cDNA 라이브러리입니다. 선택의 첫 번째 라운드는 안정 transformants에 대한 관심이 miRNA의 도입에 따라, 그리고 마지막으로, miRNA의 목표를 포함하는 cDNAs을위한 선택입니다. 선택된 cDNAs은 시퀀싱 (대상 아이디 라이브러리 워크플로우 및 자세한 내용은 그림 1-3 참조)에 의해 식별됩니다. 인간의 transcriptome의 광범위한 적용 범위를 보장하기 위해 대상 ID가 도서관 cDNAs은 여러 사람의 조직 및 세포 라인에서 준비한 총 RNA의 수영장을 사용하여 oligo-DT의 마중물을 통해 생성되었습니다. 1.2 킬로바이트의 평균 크기, 0.5에서 4 KB로 cDNA 범위를 결과 및 (플라스미드지도 그림 4 참조) p3TKzeo 이중 선택 플라스미드로 복제되었다. 리로 표현 유전자 표적brary는 시그마 - 올드 리치 웹 페이지에서 찾을 수 있습니다. Illumina 시퀀싱 (표 3)의 결과가 도서관 UCSC RefGene에서 21,518 고유한 유전자 16,922 (79 %), 또는 10 또는 읽습 이상 (66 %)로 14,000의 유전자를 포함 것을 보여줍니다.

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Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

대상 아이디 라이브러리 miRNA 목표를 식별하는 데 사용 복제된 cDNA의 플라스미드 기반의 게놈 전체 모음입니다. 여기는 이용 및 응용 프로그램을 보여줍니다.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

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Microarrays을 사용하여 tRNA의 Aminoacylation (충전) 레벨의 게놈 - 와이드 분석

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

연구

생물학

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이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

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Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

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RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

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Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

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게놈 넓은 식별 및 소문의 ATL E3 유비퀴틴 리가 유전자 가족의 식 메타 분석을 위한 포괄적인 워크플로

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...