Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Vi takker hele Sigma Life Science Mission Target ID Library utvikling team, spesielt Kevin Gutshall for å finne den teknologien og forhandle lisensvilkårene, og Heather Holemon for hennes støtte og deltakelse i fruktbare feilsøking diskusjoner. Vi takker også Dr. Joop Gäken av Kings College London for fritt dele upubliserte resultater og forslag, og Qazi Hamid av RxBiosciences for å forberede en stor bunke cDNA og hans utholdenhet i å få det klonet. Vi ønsker å anerkjenne Nan Lin og Scott Bahr fra SAFC for å utføre cDNA arrays og dataanalyse. MISSION er et registrert varemerke for Sigma-Aldrich Bioteknologi LP

<ol>
	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li><li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desperately+seeking+microRNA+targets.">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li><li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li><li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer.">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li><li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-221+and+miR-222,+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas,+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle.">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene.">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncoding+RNA,+miR-126,+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers.">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Forfattere erklære økonomiske relasjoner med kommersielle enheter som har en interesse i det innleverte arbeidet.

microRNAs er 20-24 nukleotid RNA som regulerer genuttrykk post-transcriptionally ved å hemme mRNA oversettelse, og ofte, destabilisere målrettet mRNA (anmeldt i [6]). En enkelt miRNA kan regulere flere hundre mRNAs å styre en celle respons på utviklingsmessige og miljømessige signaler. Identifisering og validere målet mRNA er avgjørende for å bestemme en miRNA rolle og funksjon i disse banene. Imidlertid er målet identifikasjon ikke enkelt fordi, i dyr, miRNAs og deres målwebområder er ikke helt komplementære. Den &quot;frø&quot; region, bygger 2 til 7 fra 5&#39;-enden av miRNA, er vanligvis komplementær til sine mål. Det finnes imidlertid mange unntak fra frø regelen, og nedstrøms base-paring kan kompensere for en ufullkommen frø kamp. En rekke datamaskinalgoritmer har blitt utviklet for å forutsi miRNA mål basert på frø matching og nedstrøms kompensasjon, målet struktur end posisjon, sekvens bevaring, og diverse andre parametere som er observert for eksperimentelt validerte mål (anmeldt i [7]). Mens i silico spådommer er praktisk og gjør identifisere mange gyldige miRNA mål, spådde de fleste gener mislykkes eksperimentelle validering tester, og mange faktiske mål er ikke spådd. Videre, siden datamaskinalgoritmer er basert på tidligere fastsatte målet funksjoner, har de ikke tillater oppdagelse av mål som avviker fra det som allerede er kjent. En rekke eksperimentelle systemer har vært brukt med hell til å identifisere eller finne funksjonelle miRNA mål i levende celler. Disse globale screening metodene inkluderer mikromatriser og RNA sekvensering, RNA co-immunoprecipitation (RIP), og stabil isotop Merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC), en proteomikk metode (anmeldt i [7]). Hver metode har fordeler og ulemper. Siden miRNA målretting destabiliserer ofte en mRNA og fører til dens degradering, tap or gevinst i mRNA nivå etter innføring av en miRNA etterligne eller hemmer henholdsvis kan identifisere miRNA mål. Dette tapet eller gevinsten av mRNA er lett oppdages av microarray eller dyp-sekvensering. Mens mRNA påvisningsmetoder er enklere og mer følsom enn protein gjenkjenning metoder, vil mRNA deteksjon savne noen miRNA mål som ikke er degradert. Nylige rapporter fra Bartell lab sammenligner miRNA resultatmål fra RNA deteksjon med de fra SILAC [8] eller ribosomet profilering [9] tyder på at pattedyr miRNAs hovedsakelig handle ved å redusere målet mRNA nivåer. Imidlertid har mange andre laboratorier som arbeider med individuelle miRNA mål påvist endring i protein, men ingen endring i mRNA nivå. Rapporter om hva synes å være translasjonell regulering uten påvisbare mRNA tap inkluderer: Mir-10B på HOXD10 [10], miR221/222 på p27kip1 [11], Mir-21 på Pdcd4 [12], Mir-126 på p85β [13] , Mir-34 på SIRT1 [14], Mir-21 på PTEN [15], Mir-302d på Arid4b [16], Mir-200C på JAG1 [17], og Mir-299, 297, 567, ennd 609 på VEGFA [18]. Videre Clancy et al [19] nylig rapportert at translasjonsforskning regulering av let-7 ble bare oppdaget når individuelle mRNA isoformer som inneholder la-7 målområde ble oppdaget selektivt. Sistnevnte tyder på at i hvert fall i noen tilfeller kan translasjonsperspektiv regulering bli oversett i en sammensatt profil - det vil si når alle mRNA isoformer blir oppdaget som en mRNA - som fås med mange microarray og rekkefølge analyser. Co-immunoprecipitation av miRNA-mRNA komplekser via argonaute (vanligvis ago2) eller en annen assosiert protein (RNA immunoprecipitation, eller RIP) vil isolere miRNA mål uavhengig av regulering mekanisme. I tillegg oppdager RIP endogen, og formodentlig biologisk relevant, interaksjoner. Det er imidlertid ikke kjent om alle miRNA-mRNA interaksjoner er funksjonelle, og RIP ville savne noen mRNA mål som forbinder bare forbigående eller er raskt degradert. Videre må spesifikke miRNA-mRNA partnere utledes bioinformatitisk fordi alle miRNA-mRNA par co-utfelt sammen. Til slutt, identifiserer SILAC direkte endelige produktet av miRNA regulering, proteinet i seg selv, men er ufølsom og derfor savner sjeldne proteiner og små brett endringer i protein nivåer. I lys av de begrensninger med dagens miRNA målet identifikasjon metoder, følte vi en ytterligere global analyse for å identifisere funksjonelle miRNA mål ved en alternativ mekanisme var nødvendig. For å oppfylle dette behovet, lisensiert vi en teknologi oppfunnet av Joop Gaken og Azim Mohamedali av Kings College London. Deres oppfinnelse er en dual utvalg fusion protein, spesielt, en tymidinkinase-zeocin fusion, regulert av et cDNA bibliotek potensielle miRNA mål sekvenser i 3&#39;UTR sin. Celler stabilt transfekterte med og uttrykke TKzeo-cDNA konstruerer kan velges med zeocin, som illustrert i figur 2. Etter uttrykker en miRNA av interesse, kan det miRNA målsettinger velges with ganciklovir, som illustrert i figur 3.. Ganciklovir dreper celler uttrykker tymidinkinase, som er, eventuelle celler uttrykker TKzeo-cDNA mangler et mål for miRNA av interesse. Målrettet cDNA kan isoleres ved PCR amplifisering av DNA fra celler som overlever ganciklovir bruker primere som flankerer cDNA, og PCR-produkter kan bli sekvensert å identifisere mål. Vi har utviklet Kings College teknologi inn i et nytt verktøy for global identifisering og oppdagelse av funksjonelle menneskelige miRNA mål - MISSION Target ID Library. Med Target ID Library, kan brukerne isolere miRNA mål av en rekke pattedyr cellekultur transfeksjon og narkotika valg trinn. Biblioteket er omfattende, og inneholder 66-79% av menneskets gener. Foreløpige resultatene tyder på at både tidligere oppdaget så vel som nye mål kan bli isolert fra MISSION Target ID Library. Selv om protokollen er av noen lengde,bruk av Target ID biblioteket krever standard molekylære lab teknikker - pattedyrcelle kultur, transfeksjon, narkotika utvalg, PCR, og sekvensering - og derfor bør være godt innenfor middel for de fleste biologer. Vi foreslår at tilstrekkelig oppmerksomhet rettes mot riktig eksperimentell design, optimalisering kultur vilkår, og viktigst, pre-testing hver ny celletype å bestemme optimale nivåer av legemiddel for valg trinn (kill-kurver) for å sikre suksess med Target ID Library. Som med alle miRNA mål identifikasjon metoder, er det sterkt anbefalt at målene identifisert ved screening Target ID Library bli validert med en andre metoden, som microarray, QRT-PCR, reporter analysen (dvs. luciferase), eller vestlig analyse.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq ReadyMix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciklovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute pattedyr Genomisk DNA Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Spesifikk Nucleofection kden </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Target ID Library </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

Målet ID Library er utviklet for å hjelpe i funn og identifisering av mikroRNA (miRNA) mål. Målet ID Library er en plasmid-basert, genom-wide cDNA bibliotek klonet inn i 3&#39;UTR nedstrøms fra dual-utvalget fusion protein, tymidinkinase-zeocin (TKzeo). Den første runden av valget er for stabile transformants, fulgte med innføringen av en miRNA av interesse, og til slutt, velge for cDNAs inneholder miRNA mål. Valgte cDNAs identifiseres ved sekvensering (se figur 1-3 for Target ID Library Arbeidsflyt og detaljer). For å sikre bred dekning av det menneskelige transkriptom ble Target ID Library cDNAs genereres via oligo-dT priming ved hjelp av en pool av total RNA forberedt fra flere menneskelige vev og cellelinjer. Resulterende cDNA varierer fra 0,5 til 4 kb, med en gjennomsnittlig størrelse på 1,2 kb, og ble klonet inn i p3TKzeo dual-utvalget plasmid (se figur 4 for plasmid kart). Genet målene representert i library kan bli funnet på Sigma-Aldrich nettside. Resultater fra Illumina sekvensering (tabell 3), viser at biblioteket inneholder 16 922 av de 21,518 unike gener i UCSC RefGene (79%), eller 14.000 gener med 10 eller flere leser (66%).

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Målet ID Library er en plasmid-basert, genom-wide samling av klonet cDNA brukes til å identifisere miRNA mål. Her har vi demonstrere sin bruk og anvendelse.

Genome-wide Screen for miRNA Targets Bruke MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

MISSION LentiPlex Samlede shRNA Library Screening i pattedyrceller

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Kvantitative og Automated High-throughput Genome-wide RNAi skjermer i C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesiansk Change-point algoritme for Genome-wide analyse av Diverse ChIPseq Datatyper

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Påvisning av miRNA Targets i High-throughput Bruke 3&#39;LIFE analysen

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genome-wide Kartlegging av narkotika DNA Interactions i Cells med COSMIC (Fornetting av små molekyler å isolere Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Genome-wide Rensing av ekstrakromosomalt sirkulært DNA fra eukaryote celler

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Omfattende arbeidsflyten for genomet-identifikasjon og uttrykk Meta-analyse av ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene familien i Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...