Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
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Agradecemos toda a vida Sigma Ciência Missão Alvo ID equipe de desenvolvimento da biblioteca, especialmente Kevin Gutshall para encontrar a tecnologia e negociar os termos de licença e Heather Holemon por seu apoio e participação nas discussões de problemas frutíferas. Agradecemos também a Dr. Joop Gäken de Faculdade Londres do rei para livremente compartilhar os resultados inéditos e sugestões, e Qazi Hamid RxBiosciences para a preparação de um lote grande de cDNA e sua persistência em consegui-lo clonado. Nós gostaríamos de agradecer Nan Lin e Scott Bahr de SAFC para a realização de arranjos de cDNA e análise de dados. MISSÃO é uma marca registrada da LP Biotecnologia Sigma-Aldrich

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	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li><li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desperately+seeking+microRNA+targets.">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li><li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li><li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer.">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li><li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-221+and+miR-222,+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas,+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle.">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene.">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncoding+RNA,+miR-126,+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers.">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Os autores declaram relações financeiras com entidades comerciais que tenham interesse no trabalho apresentado.

microRNAs são RNAs de 20-24 nucleotídeos que regulam a expressão gênica pós-transcricional pela tradução do mRNA inibição e, freqüentemente, desestabilizar o mRNA alvo (revisto em [6]). Um único miRNA pode regular várias centenas de mRNAs para controlar a resposta de uma célula a sinais ambientais e de desenvolvimento. Identificação e validação de mRNAs alvo é essencial para determinar o papel de um miRNA e função nestas vias. No entanto, a identificação do alvo não é simples porque, em animais, miRNAs e seus locais-alvo não são totalmente complementares. A &quot;semente&quot; região, baseia 2 a 7 a partir da extremidade 5 &#39;da miRNA, é geralmente complementar aos seus alvos. No entanto, existem muitas exceções à regra de sementes, ea jusante emparelhamento de bases pode compensar uma correspondência semente imperfeita. Um certo número de algoritmos de computador têm sido desenvolvidos para prever alvos miRNA baseado em correspondência de sementes e de compensação a jusante, uma estrutura alvoposição d, conservação da sequência, e vários outros parâmetros que têm sido observados para alvos validados experimentalmente (revisto em [7]). Enquanto in silico previsões são convenientes e se identificam muitos alvos miRNA válidos, a maioria previu genes falhar os testes de validação experimental, e muitos alvos reais não são previstos. Além disso, desde algoritmos de computador são baseados em características-alvo previamente determinados, eles não permitem a descoberta de alvos que se afastam do que já é conhecido. Um certo número de sistemas experimentais têm sido utilizados com sucesso para identificar ou descobrir alvos miRNA funcionais em células vivas. Estes métodos de rastreamento globais incluem microarrays e sequenciamento de RNA, RNA co-imunoprecipitação (RIP), e Rotulagem Isótopos Estáveis ​​com Aminoácidos em cultura de células (SILAC), um método de proteômica (revisto em [7]). Cada método tem vantagens e desvantagens. Uma vez que miRNA segmentação frequentemente desestabiliza um mRNA e leva a sua degradação, uma perdar ganho no nível de ARNm após a introdução de um miRNA imitar ou inibidor, respectivamente, podem identificar alvos miRNA. Esta perda ou ganho de mRNA é facilmente detectada por microarray ou sequenciação de profundidade. Enquanto os métodos de detecção de mRNA são mais simples e mais sensível do que os métodos de detecção de proteínas, detecção de mRNA vai perder todos os alvos do miRNA que não são degradados. Relatórios recentes do laboratório Bartell comparando os resultados da detecção de miRNA-alvo RNA com os de SILAC [8] ou perfil ribossoma [9] indicam que os miRNAs mamíferos predominantemente agir, reduzindo os níveis de mRNA alvo. No entanto, muitos outros laboratórios que trabalham com metas de miRNA individuais detectaram alteração na proteína, mas nenhuma mudança no nível de mRNA. Relatos de que parece ser translacional regulação sem perda mRNA detectável incluem: miR-10b em HOXD10 [10], miR221/222 em p27KIP1 mostrou [11], miR-21 em Pdcd4 [12], miR-126 em p85β [13] , miR-34 em SIRT1 [14], miR-21 em PTEN [15], miR-302D em Arid4b [16], miR-200c em JAG1 [17], e miR-299, 297, 567, umnd 609 em VEGFA [18]. Além disso, Clancy et al [19] relatou recentemente que a regulação traducional por let-7 só foi detectado quando isoformas de RNAm individuais que contêm o local de let-7-alvo foram detectados de forma selectiva. A segunda sugere que, pelo menos em alguns casos, a regulação de translação pode ser negligenciada em um perfil compósito - isto é, quando todas as isoformas de mRNA são detectadas como uma mRNA - como obtido com microarray muitos e análise de sequências. Co-imunoprecipitação de miRNA mRNA complexos através Argonaute (geralmente ago2) ou outra proteína associada (RNA imunoprecipitação, ou RIP) vai isolar alvos miRNA independentemente do mecanismo de regulação. Além disso, RIP detecta endógena, e presumivelmente biologicamente relevantes, interacções. No entanto, não se sabe se todas as interacções miRNA de mRNA-são funcionais, e RIP perderia todos os objectivos de ARNm que se associam apenas transitoriamente ou são rapidamente degradados. Além disso, miRNA específicos de mRNA-parceiros deve ser inferida bioinformaticamente porque todos os pares de mRNA miRNA-co-precipitado em conjunto. Finalmente, SILAC directamente identifica o produto final de regulação miRNA, a própria proteína, mas é insensível e, portanto, perde proteínas raras e as pequenas alterações vezes nos níveis de proteína. À luz das limitações com os actuais métodos de identificação de miRNA-alvo, sentimos um ensaio adicional global para identificar alvos miRNA funcionais por um mecanismo alternativo foi necessário. Para suprir essa necessidade, que licenciou uma tecnologia inventada por Joop Gaken e Mohamedali Azim de Faculdade Londres do rei. A invenção é uma proteína de fusão dupla selecção, especificamente, uma timidina-quinase de fusão zeocin, regulada por uma biblioteca de cDNA de sequências de miRNA potenciais alvo na sua 3&#39;UTR. Células estavelmente transfectadas com e expressando TKzeo-cDNA construções podem ser seleccionados com zeocin, conforme ilustrado na Fig. 2. Depois de expressar um miRNA de interesse, as metas que miRNA pode ser selecionado with ganciclovir, como ilustrado na Fig. 3. Ganciclovir mata as células expressando timidina-quinase, ou seja, as células expressando TKzeo-cDNA falta um alvo para a miRNA de interesse. Targeted cDNA pode ser isolado por amplificação por PCR de DNA a partir de células que sobrevivem ganciclovir iniciadores utilizando que flanqueiam os produtos de cDNA, e PCR podem ser sequenciados para identificar alvos. Temos desenvolvido tecnologia da Kings College em uma nova ferramenta para a identificação global e descoberta de metas funcionais miRNA humanos - a MISSÃO Biblioteca ID Target. Com a biblioteca de ID do alvo, os utilizadores podem isolar alvos miRNA por uma série de transfecção das células de mamíferos cultura e os passos de selecção de drogas. A Biblioteca é abrangente, e contém 66-79% de genes humanos. Os resultados iniciais indicam que tanto a descoberto anteriormente, bem como novos alvos podem ser isolados a partir da biblioteca ID MISSÃO alvo. Embora o protocolo é de alguma extensão,uso da Biblioteca identificação de destino exige técnicas padrão de laboratório molecular - cultura de células de mamíferos, transfecção, a seleção de drogas, PCR, e seqüenciamento - e, portanto, deve ser bem no meio da maioria dos biólogos. Sugerimos que a atenção suficiente ser pago ao delineamento experimental adequado, otimizando as condições de cultura e, mais importante, pré-teste de cada novo tipo de célula para determinar os níveis ótimos de drogas para as etapas de seleção (matar-curvas) para garantir o sucesso com a Biblioteca ID Target. Tal como acontece com todos os métodos de identificação de miRNA alvo, é altamente recomendável que os alvos identificados pela triagem da biblioteca ID do alvo ser validado com um segundo método, tal como microarray, qRT-PCR, o ensaio de repórter (isto é, luciferase), ou análise de Western.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute mamíferos Genomic DNA Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Célula k Nucleofection específicaele </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Identificação do destino Biblioteca </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

A Biblioteca de ID Alvo é projetado para ajudar nas metas de descoberta e identificação de microRNA (miRNA). A biblioteca de ID do alvo é um plasmídeo baseado em biblioteca de todo o genoma de cDNA clonado a jusante 3&#39;UTR a partir da proteína de fusão de selecção de dupla, timidina-quinase zeocin (TKzeo). A primeira rodada de seleção é para transformantes estáveis, seguido com a introdução de um miRNA de interesse, e, finalmente, a seleção de cDNAs contendo a meta de miRNA. CDNAs selecionados são identificados por seqüenciamento (ver Figura 1-3 Fluxo de Trabalho para a Target Biblioteca ID e detalhes). Para garantir uma ampla cobertura do transcriptoma humano, Target ID Biblioteca cDNAs foram gerados através de oligo-dT priming usando um pool de ARN total preparado a partir de vários tecidos humanos e linhas celulares. Resultando gama de cDNA de 0,5 a 4 kb, com um tamanho médio de 1,2 kb, e foram clonados no dupla-selecção p3TKzeo plasmídeo (ver Figura 4 para o mapa do plasmídeo). Os alvos de genes representados na library podem ser encontradas no site da Sigma-Aldrich. Os resultados de sequenciação Illumina (Tabela 3), mostram que a biblioteca inclui 16.922 dos 21,518 genes únicos em UCSC RefGene (79%), ou 14.000 genes com 10 ou mais lê (66%).

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Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

A Biblioteca de ID de destino é um plasmídeo baseado em coleta de todo o genoma de cDNA clonado usado para identificar alvos miRNA. Aqui nós demonstrar o seu uso e aplicação.

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