Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Мы благодарим всю жизнь Sigma наук Миссия Target ID библиотеки разработчиков, особенно Кевин Gutshall нахождения технологии и переговоры условиями лицензии, и Хизер Holemon за ее поддержку и участие в плодотворных дискуссий неисправностей. Мы также благодарим доктора Joop Gäken из Королевского колледжа в Лондоне для свободного обмена неопубликованные результаты и предложения, и Кази Хамид из RxBiosciences для подготовки большой партии кДНК и его настойчивость в получении его клонировать. Мы хотели бы выразить признательность Нань Линь и Скотт Бахр от SAFC для выполнения кДНК массивов и анализа данных. Миссия является зарегистрированным товарным знаком Sigma-Aldrich биотехнологии LP

<ol>
	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li><li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desperately+seeking+microRNA+targets.">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li><li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li><li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer.">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li><li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-221+and+miR-222,+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas,+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle.">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene.">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncoding+RNA,+miR-126,+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers.">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Авторы заявляют финансовые отношения с коммерческими структурами, которые заинтересованы в представленной работе.

микроРНК являются 20-24 нуклеотидных РНК, которые регулируют экспрессию генов после транскрипционно путем ингибирования перевод мРНК, и часто, дестабилизации целевой мРНК (см. обзор в [6]). Одной микроРНК могут регулировать несколько сотен мРНК контролировать реакцию клетки на развития и окружающей среды сигналы. Определение и утверждение целевой мРНК имеет важное значение в определении роли микроРНК и функции в этих путей. Тем не менее, цель идентификации не просто потому, что у животных микроРНК и их сайты цель не в полной мере дополняют друг друга. «Семя» региона, строит со 2 по 7 от 5&#39;-конца миРНК, как правило, дополнения к своей цели. Тем не менее, есть много исключений из семян правило, ниже по течению и спариванием оснований может компенсировать несовершенным матч семян. Число компьютерных алгоритмов были разработаны для прогнозирования микроРНК целей на основе соответствия семян и вниз по течению компенсации, целевой структурыг положении, последовательность сохранения, а также различные другие параметры, которые были обнаружены экспериментально подтверждены для целей (см. обзор в [7]). В то время как в кремнии предсказания удобным и сделать выявить многие действительными целями микроРНК, большинство генов предсказал неудачу экспериментальных проверку, и многие фактические цели не прогнозируется. Кроме того, поскольку компьютерные алгоритмы основаны на ранее определенных функций цели, они не позволяют открытие цели, которые отличаются от того, что уже известно. В ряде экспериментальных систем были успешно использованы для идентификации или обнаружить функциональные цели микроРНК в живых клетках. Эти глобальные методы обследования включают микрочипов и РНК последовательности, РНК совместной иммунопреципитации (RIP), маркировка и стабильный изотоп с аминокислоты в культуре клеток (SILAC), протеомных методов (см. обзор в [7]). Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. С микроРНК ориентации часто дестабилизирует мРНК и приводит к ее деградации, потери оГ выигрыш в уровне мРНК после введения микроРНК имитировать или ингибиторов, соответственно, может идентифицировать микроРНК целей. Эта потеря или приобретение мРНК легко обнаружить микрочипов или глубокой последовательности. Хотя методы обнаружения РНК проще и более чувствительны, чем методы обнаружения белка, мРНК обнаружения пропустите ни микроРНК цели, которые не деградировали. Недавние сообщения из лаборатории Bartell сравнения результатов микроРНК цель от обнаружения РНК с теми, от SILAC [8] или рибосома профилирования [9] показали, что микроРНК млекопитающих преимущественно действуют за счет уменьшения уровня целевой мРНК. Тем не менее, многих других лабораториях, работающих с отдельными целями микроРНК обнаружены изменения белка, но никаких изменений в уровне мРНК. Доклады что, кажется, поступательное регулирование, не обнаруживается потеря мРНК включают в себя: Мир-10b на HOXD10 [10], miR221/222 на p27kip1 [11], Мир-21 на Pdcd4 [12], микроРНК-126 p85β [13] Мир-34 на SIRT1 [14], Мир-21 на PTEN [15], Мир-302d на Arid4b [16], Мир-200С на JAG1 [17], и микроРНК-299, 297, 567,609-й VEGFA [18]. Кроме того, Клэнси и др. [19] недавно сообщили, что поступательное регулирование let-7 была обнаружена только при отдельных изоформ мРНК, которые содержат let-7 целевом сайте были обнаружены выборочно. Последняя предполагает, что, по крайней мере в некоторых случаях, поступательное регулирования могут остаться незамеченными в композитных профилей - то есть, когда все изоформы мРНК обнаружении одной мРНК - как получить со многими микрочипов и последовательность анализа. Со-иммунопреципитации миРНК-мРНК комплексов через Argonaute (обычно ago2) или другой связанный белок (РНК иммунопреципитации или RIP) будет изолировать миРНК цели независимо от того, механизм регулирования. Кроме того, RIP определяет эндогенные, и, предположительно, биологически значимым, взаимодействий. Тем не менее, не известно, все ли микроРНК-мРНК взаимодействия функциональных и RIP будет не хватать любой мРНК целей, которые связывают только временно или быстро деградирует. Кроме того, в конкретных миРНК-мРНК партнеры должны быть выведены bioinformatiски, потому что все миРНК-мРНК пар со-осаждается вместе. Наконец, SILAC непосредственно определяет конечный продукт микроРНК регулирования, самого белка, но без учета регистра, и поэтому пропускает редкие белки и небольшие раз изменения уровня белка. В свете ограничения современных методов идентификации микроРНК цель, мы чувствовали себя дополнительные глобального анализа для выявления функциональных целей микроРНК на альтернативный механизм было необходимо. Чтобы выполнить эту задачу, мы лицензировали технологии изобретены Joop Gaken и Азим Mohamedali из Королевского колледжа в Лондоне. Их изобретение является двойной гибридного белка выбор, в частности, тимидинкиназы-zeocin синтеза, регулируются библиотеки кДНК потенциальных микроРНК целевой последовательности в 3&#39;UTR. Клетки стабильно трансфицированных и выражая TKzeo-кДНК конструкциями могут быть выбраны с zeocin, как показано на рисунке 2. После выражения микроРНК интересов, целей, микроРНК может быть выбран шм ганцикловир, как показано на рисунке 3. Ганцикловир убивает клетки, экспрессирующие тимидинкиназы, то есть любой клетки, экспрессирующие TKzeo-кДНК отсутствует мишень для микроРНК интерес. Целевые кДНК могут быть выделены путем ПЦР-амплификации ДНК из клеток, которые выживают ганцикловиром с использованием праймеров, что фланг кДНК и ПЦР-продукты могут быть упорядочены для определения целей. Мы разработали технологию колледже короля в новый инструмент для глобальной идентификации и обнаружения человека функциональных целей микроРНК - ID МИССИЯ целевой библиотеки. В библиотеке ID Target, пользователи могут изолировать миРНК цели рядом млекопитающих трансфекции клеточных культур и меры выбор препарата. Библиотека носит комплексный характер и содержит 66-79% генов человека. Первые результаты показывают, что как ранее открытых, так и новые цели могут быть выделены из библиотеки ID целевой МИССИИ. Хотя протокол некоторой длины,использование библиотеки ID целевой требует стандартных способов молекулярной лаборатории - культуры клеток млекопитающих, трансфекция, выбор препарата, ПЦР и секвенирования - и, следовательно, должна быть в пределах средств большинство биологов. Мы полагаем, что достаточно внимания уделять надлежащее опытно-конструкторских, оптимизации условий культивирования, а главное, предварительное тестирование каждого нового типа клеток, чтобы определить оптимальный уровень препарата для выбора шагов (kill-кривые), чтобы обеспечить успех с библиотекой ID цели. Как и во всех микроРНК методы опознавания цели, настоятельно рекомендуется, чтобы цели, определенные путем скрининга библиотеки Target ID быть проверены с помощью второго метода, такие, как микрочипы, QRT-PCR, репортер анализа (например, люциферазы), или западные анализа.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ганцикловир </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Пуромицин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo Т.А. </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute млекопитающих геномной ДНК Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Сотовые Конкретные к Nucleofectionэто </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Target ID библиотеки </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

Библиотека Target ID предназначен для оказания помощи в открытии и идентификации микроРНК (миРНК) целей. Библиотека Target ID является плазмида основе, генома библиотеки кДНК клонировали в 3&#39;UTR вниз по течению от двойного отбора гибридного белка, тимидинкиназы-zeocin (TKzeo). Первый раунд отбора для стабильного трансформантов, а затем с введением микроРНК интерес, и, наконец, выбрать для кДНК содержащих цель в микроРНК. Выбранный кДНК определяются последовательности (см. Рисунок 1-3 для Target ID Workflow Библиотеки и детали). Для обеспечения широкого охвата человека транскриптом, Target ID библиотеки кДНК были получены с помощью олиго-дТ грунтовки использованием пула тотальной РНК готовят из нескольких человеческих тканей и клеточных линиях. В результате кДНК в диапазоне от 0,5 до 4 кб, со средним размером 1,2 кб, и были клонированы в p3TKzeo двойного выбора плазмид (см. Рисунок 4 карта плазмиды). Ген целей, представленных в лиbrary можно найти на Sigma-Aldrich веб-страницы. Результаты Illumina последовательности (табл. 3) показывают, что библиотека включает в себя 16 922 из 21 518 уникальных генов в УСК RefGene (79%), или 14 000 генов с 10 или более чтения (66%).

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Библиотека Target ID является плазмида основе, генома коллекции клонированных кДНК используется для идентификации микроРНК целей. Здесь мы показываем его использования и применения.

Генома экран для микроРНК цели с помощью ID МИССИЯ целевой библиотеки

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Генома Анализ аминоацилирования (зарядка) уровни тРНК Использование Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

МИССИЯ LentiPlex Объединенные shRNA библиотеки Скрининг в клетках млекопитающих

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Количественные и автоматизированных высокой пропускной генома RNAi экраны в С. Элеганс</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

Роман байесовского Изменение точки Алгоритм всему геному анализ различных типов данных ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

По всему геному Гена удаления в<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Обнаружение микроРНК цели в высокой пропускной Использование 3&#39;LIFE Пробирной

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Генома Отображение лекарственно-ДНК взаимодействий в клетках с космическими (сшивание малых молекул изолировать хроматина)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Генома Очистка экстрахромосомального кольцевой ДНК из эукариотических клеток

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Всеобъемлющий рабочий процесс для идентификации генома и выражение мета анализа семьи ATL E3 убиквитин лигаза гена в Грейпвайне

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...