Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
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Damos las gracias a toda la vida Sigma Misiones Científicas de la ID de destino Biblioteca equipo de desarrollo, especialmente Kevin Gutshall para encontrar la tecnología y la negociación de los términos de licencia, y Holemon Heather por su apoyo y participación en los debates fructíferos de solución de problemas. También agradecemos al Dr. Joop Gäken del King College de Londres por haber compartido los resultados no publicados y sugerencias, y Qazi Hamid de RxBiosciences para la preparación de un lote grande de cDNA y su persistencia en conseguir que clonado. Nos gustaría agradecer Nan Lin y Bahr Scott de SAFC para la realización de las matrices de cDNA y análisis de datos. MISIÓN es una marca registrada de Sigma-Aldrich Biotecnología LP

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	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. 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Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Los autores declaran las relaciones financieras con entidades comerciales que tienen un interés en los trabajos presentados.

microRNAs son 20-24 ARN de nucleótidos que regulan la expresión de genes post-transcripcional por la inhibición de la traducción del ARNm, y con frecuencia, la desestabilización del ARNm diana (revisado en [6]). Una sola miARN puede regular varios cientos de ARNm para controlar la respuesta de una célula a las señales de desarrollo y medio ambiente. La identificación y validación de mRNAs objetivo es fundamental para determinar el papel de un miRNA y la función de estas vías. Sin embargo, la identificación de objetivos no es fácil porque, en los animales, los miRNAs y sus sitios de destino no son totalmente complementarias. La &quot;semilla&quot; región, basa 2 a 7 desde el extremo 5 &#39;del miARN, es generalmente complementaria de sus objetivos. Sin embargo, hay muchas excepciones a la regla de la semilla, y aguas abajo de apareamiento de bases puede compensar un partido de la semilla imperfecta. Una serie de algoritmos computacionales se han desarrollado para predecir los genes miARN objetivos basados ​​en la correspondencia de la semilla y la compensación aguas abajo, una estructura de destinoposición D, la secuencia de conservación, y varios otros parámetros que se hayan observado en los objetivos validados experimentalmente (revisado en [7]). Si bien las predicciones in silico son convenientes y hacer válidos los objetivos de identificar muchos genes miARN, la mayoría de los genes no predijo las pruebas experimentales de validación, y muchos objetivos reales no se predijo. Por otra parte, ya que los algoritmos informáticos se basan en las características de destino previamente determinados, que no permiten el descubrimiento de los objetivos que se apartan de lo ya conocido. Un número de sistemas experimentales se han utilizado con éxito para identificar o descubrir los objetivos funcionales miARN en células vivas. Estos métodos de detección globales incluyen microarrays y la secuenciación del ARN, el ARN co-inmunoprecipitación (RIP), y el etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC), un método de proteómica (revisado en [7]). Cada método tiene ventajas y desventajas. Desde miARN objetivo suele desestabilizar un ARNm y conduce a su degradación, pérdida oel aumento de r en el nivel del mRNA después de la introducción de un miARN imitar o inhibidor, respectivamente, pueden identificar los genes miARN objetivos. Esta pérdida o ganancia de ARNm es fácilmente detectada por microarrays o la secuenciación de profundidad. Mientras que los métodos de detección de mRNA son más simples y más sensibles que los métodos de detección de proteínas, la detección de mRNA se falte a ninguna de los genes miARN objetivos que no se degradan. Los últimos informes del laboratorio comparando los resultados Bartell miARN objetivo de la detección de RNA con los de SILAC [8] o el perfil del ribosoma [9] indican que los miRNAs mamíferos principalmente actúa reduciendo los niveles de mRNA diana. Sin embargo, muchos otros laboratorios que trabajan con los genes miARN objetivos individuales se han detectado cambios en proteínas, pero ningún cambio en el nivel del mRNA. Los informes de lo que parece ser la regulación de traducción sin pérdida de ARNm detectable incluyen: miR-10b en la HOXD10 [10], en miR221/222 p27kip1 [11], miR-21 en Pdcd4 [12], miR-126 en p85β [13] , miR-34 en la SIRT1 [14], miR-21 en el PTEN [15], el miR-302d en Arid4b [16], el miR-200c en JAG1 [17], y miR-299, 297, 567, unº 609 de VEGF [18]. Por otra parte, Clancy et al [19] informó recientemente que la regulación de traducción por let-7 fue detectado sólo cuando las isoformas individuales de ARNm que contienen el sitio de destino vamos-7 se detectaron de forma selectiva. Lo anterior sugiere que, al menos en algunos casos, la regulación de traducción puede ser pasado por alto en un perfil compuesto - es decir, cuando todas las isoformas de mRNA se detectan como un ARNm - tal como se obtiene con microarrays muchos y los análisis de secuencias. Co-inmunoprecipitación de los complejos de mRNA de los genes miARN-a través de Argonauta (por lo general ago2) u otra proteína asociada (ARN inmunoprecipitación, o RIP) va a aislar los genes miARN objetivos con independencia del mecanismo de regulación. Además, PIR detecta endógeno, y, presumiblemente, biológicamente relevante, las interacciones. Sin embargo, no se sabe si todas las interacciones de mRNA miARN-son funcionales, y el PIR se pierda ninguna mRNA objetivos que se asocian sólo transitoriamente o se degradan rápidamente. Además, específicas de ARNm miRNA-socios debe inferirse bioinformaticamente, porque todos los pares de ARNm de miRNA-co-precipitado juntos. Finalmente, SILAC directamente identifica el producto final de la regulación miARN, la propia proteína, pero es insensible y por lo tanto se pierde proteínas raras y pequeños cambios en los niveles de proteína de plegado. A la luz de las limitaciones con los métodos actuales de identificación de los genes miARN objetivo, nos sentimos un ensayo adicional global para identificar los objetivos funcionales miARN por un mecanismo alternativo que se necesitaba. Para cumplir con esta necesidad, la licencia de una tecnología inventada por Joop Gaken y Azim Mohamedali del King College de Londres. Su invención es una proteína de fusión de selección doble, en concreto, una timidina quinasa zeocin fusión, regulado por una biblioteca de cDNA de las posibles secuencias de miRNA en su objetivo 3&#39;UTR. Las células transfectadas de manera estable y expresar TKzeo-cDNA construcciones se pueden seleccionar con zeocin, como se ilustra en la figura 2. Después de expresar un miARN de interés, los objetivos que Mirna se puede seleccionar wiª ganciclovir, como se ilustra en la figura 3. Ganciclovir mata las células que expresan la timidina quinasa, es decir, cualquier célula que expresa TKzeo-cDNA carece de un objetivo para el miARN de interés. Dirigida ADNc se puede aislar mediante amplificación por PCR del ADN de las células que sobreviven ganciclovir cebadores que flanquean utilizando los productos de cDNA, y la PCR puede ser secuenciado para identificar dianas. Hemos desarrollado la tecnología del King &#39;s College en una nueva herramienta para la identificación global y el descubrimiento de los genes miARN objetivos funcionales humanos - el objetivo de la misión Carnet de identificación. Con la Biblioteca ID de destino, los usuarios pueden aislar los genes miARN objetivos por una serie de transfección de mamífero cultivo de células y los pasos de drogas de selección. La Biblioteca es amplio, y contiene 66-79% de los genes humanos. Los resultados iniciales indican que tanto descubierto anteriormente, así como nuevos objetivos pueden ser aislados de la biblioteca MISIÓN ID de destino. Aunque el protocolo es de cierta extensión,el uso de la Biblioteca de ID de destino requiere de técnicas estándar de laboratorio moleculares, cultivo de células mamíferas, la transfección, selección de medicamentos, PCR y secuenciación - y por lo tanto, debe estar bien al alcance de la mayoría de los biólogos. Se sugiere que se preste suficiente atención a un diseño experimental adecuado, optimizando las condiciones de cultivo, y lo más importante, antes de la prueba de cada nuevo tipo de células para determinar los niveles óptimos de drogas para los pasos de selección (kill-curvas) para asegurar el éxito con el Carnet de identificación de destino. Al igual que con todos los métodos de identificación de genes miARN objetivo, se recomienda que los objetivos identificados por cribado de la Biblioteca de ID de destino debe ser validado con un segundo método, tales como microarrays, QRT-PCR, reportero de ensayo (es decir, la luciferasa), o el análisis occidental.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> JumpStart RedTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> El ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute mamíferos ADN genómico Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Celular k nucleofection específicolo </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> ID de destino Biblioteca </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

La Biblioteca de ID de destino está diseñado para ayudar en los objetivos de descubrimiento e identificación de los microARN (miRNA). La Biblioteca de ID de destino es un plásmido basado en el genoma biblioteca de cDNA clonado en el 3&#39;UTR aguas abajo de la proteína de fusión de dos de selección, la timidina quinasa zeocin (TKzeo). La primera ronda de selección es para transformantes estables, seguido con la introducción de un miARN de interés, y finalmente, la selección de ADNc que contienen el objetivo de miARN. ADNc seleccionados se identificaron mediante la secuenciación (véase la Figura 1-3 para flujo de trabajo de la Biblioteca de ID y los detalles). Para asegurar una cobertura amplia del transcriptoma humano, Target ID Biblioteca cDNA se generaron a través de oligo-dT cebado con un grupo de ARN total preparado a partir de múltiples tejidos humanos y líneas celulares. Resultando gama de ADNc de 0,5 a 4 kb, con un tamaño medio de 1,2 kb, y se clonaron en el p3TKzeo doble selección plásmido (véase la Figura 4 Mapa de plásmido). Los objetivos de genes representados en la liblioteca se puede encontrar en la página web de Sigma-Aldrich. Los resultados de la secuenciación de Illumina (Tabla 3), muestran que la biblioteca cuenta con 16.922 de los 21,518 genes únicos en la UCSC RefGene (79%), o 14.000 genes con 10 o más lecturas (66%).

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Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

La Biblioteca de ID de destino es un plásmido basado en el genoma colección de cDNA clonado utiliza para identificar los genes miARN objetivos. Aquí nos demuestran su uso y aplicación.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

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