Name: genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Vi tackar hela Sigma Life Science Mission Target ID laget Bibliotek utveckling, särskilt Kevin Gutshall för att hitta den teknik och förhandla licensvillkoren och Heather Holemon för hennes stöd och deltagande i givande felsökning diskussioner. Vi tackar också Dr Joop Gäken av Kings College London för fritt dela opublicerade resultat och förslag och Qazi Hamid i RxBiosciences för att framställa en stor sats av cDNA och hans uthållighet att få det klonas. Vi vill tacka för Nan Lin och Scott Bahr från SAFC för att utföra cDNA arrayer och dataanalys. Mission är ett registrerat varumärke för Sigma-Aldrich Biotechnology LP

<ol>
	<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis.">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li><li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li><li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li><li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+microRNAs:+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay.">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li><li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desperately+seeking+microRNA+targets.">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li><li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li><li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer.">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li><li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-221+and+miR-222,+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas,+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle.">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene.">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncoding+RNA,+miR-126,+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers.">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li><li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis.">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li><li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 .</li><li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation.">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).</li><li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8/200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells.">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li><li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP.">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li><li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation.">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li></ol>

Författarna förklarar ekonomiska relationer med kommersiella aktörer som har ett intresse i det inlämnade arbetet.

mikroRNA är 20-24 nukleotid RNA som reglerar genuttrycket efter transkriptionellt genom att hämma mRNA translation, och ofta, destabilisera de riktade mRNA (över [6]). En enda miRNA kan reglera flera hundra mRNA för att styra en cell svar på utvecklings-och miljö-signaler. Identifiering och validering mål mRNA är viktigt att bestämma ett miRNA roll och funktion i dessa vägar. Dock är målet identifiering inte okomplicerad eftersom det i djur, miRNA och deras platser mål inte är helt komplementära. &quot;Fröet&quot;-regionen, baserar 2 till 7 från 5&#39;-änden av miRNA, är vanligen komplementär till sitt mål. Det finns dock många undantag från fröet regel och nedströms bas-parning kan kompensera för en bristfällig frö match. Ett antal algoritmer har utvecklats för att förutsäga miRNA mål som bygger på utsäde matchning och nedströms ersättning målstruktur end position, sekvenskonservering, och diverse andra parametrar som har undersökts för experimentellt validerade mål (över [7]). Även i silico förutsägelser är bekväma och gör identifiera många giltiga miRNA mål, förutspådde de flesta gener inte experimentella validering tester och många verkliga mål inte förutses. Eftersom algoritmer är baserade på tidigare fastställda mål funktioner, tillåter de inte upptäckten av mål som avviker från vad som redan känt. Ett antal experimentella system har använts framgångsrikt för att identifiera eller upptäcka funktionella miRNA mål i levande celler. Dessa globala screeningsmetoder innefattar mikromatriser och RNA-sekvensering, RNA samimmunfällning (RIP), och stabil isotop märkning med Aminosyror i cellkultur (SILAC), en metod proteomik (översikt i [7]). Varje metod har sina fördelar och nackdelar. Eftersom miRNA inriktning destabiliserar ofta en mRNA och leder till dess nedbrytning, förlust or vinst i mRNA nivå efter att införa en miRNA efterlikna eller hämmare, respektive kan identifiera miRNA mål. Denna förlust eller vinst av mRNA lätt upptäcks av microarray eller djup sekvensering. Medan mRNA detekteringsmetoder är enklare och mer känsliga än metoder protein detektion kommer mRNA detektion missar några miRNA mål som inte bryts ned. Nya rapporter från Bartell labbet jämföra resultat miRNA målet från RNA-detektion med dem från SILAC [8] eller ribosomen profilering [9] visar att däggdjur miRNA huvudsakligen verkar genom att minska nivåerna mål-mRNA. Emellertid, har många andra laboratorier som arbetar med individuella miRNA mål detekterad förändring i proteinet men ingen förändring i mRNA-nivå. Rapporter om vad som verkar vara translationell reglering utan påvisbar mRNA förluster inkluderar: miR-10b den HOXD10 [10], miR221/222 den p27kip1 [11], miR-21 på Pdcd4 [12], miR-126 på p85β [13] , miR-34 den SIRT1 [14], miR-21 på PTEN [15], miR-302d den Arid4b [16], miR-200C på JAG1 [17] och miR-299, 297, 567, ennd 609 om VEGFA [18]. Dessutom Clancy et al [19] rapporterade nyligen att translationell reglering av låt-7 endast upptäcktes när enskilda mRNA-isoformer som innehåller LET-7 målområdet upptäcktes selektivt. Den senare tyder på att åtminstone i vissa fall kan translationell reglering förbises i en sammansatt profil - det vill säga när alla mRNA-isoformer upptäcks som en mRNA - som erhållits med många microarray och analyser sekvens. Co-immunoprecipitering av miRNA-mRNA-komplex via argonaute (vanligtvis ago2) eller någon annan tillhörande protein (RNA immunoprecipitation, eller RIP) kommer att isolera miRNA mål oberoende av reglering mekanism. Dessutom upptäcker RIP endogena, och förmodligen biologiskt relevanta interaktioner. Det är dock inte känt om alla miRNA-mRNA interaktioner är funktionella och RIP skulle missa några mRNA mål som associerar enbart övergående eller snabbt försämras. Dessutom måste särskilda miRNA-mRNA partner härledas bioinformatitiskt eftersom alla miRNA-mRNA paren samutfällas tillsammans. Slutligen identifierar SILAC direkt slutprodukten av miRNA reglering, proteinet i sig, utan är okänslig och därför missar sällsynta proteiner och små gånger förändringar i protein nivåer. Mot bakgrund av de begränsningar som nuvarande identifiering miRNA mål metoder kände vi ytterligare ett globalt analys för att identifiera funktionella miRNA mål genom en alternativ mekanism behövdes. För att uppfylla detta behov licensierat vi en teknik som uppfanns av Joop Gaken och Azim Mohamedali av Kings College London. Deras uppfinning är en dubbel selektion fusionsprotein, specifikt en tymidinkinas-zeocin fusion regleras genom en cDNA-bibliotek av potentiella sekvenser miRNA mål på dess 3&#39;UTR. Celler stabilt transfekterade med och uttryckande TKzeo-cDNA-konstruktioner kan väljas med zeocin, såsom illustreras i fig. 2. Efter att uttrycka en miRNA av intresse, som kan miRNA: s mål väljas wite ganciklovir, såsom visas i fig 3. Ganciklovir dödar celler som uttrycker tymidinkinas, det vill säga, vilka som helst celler som uttrycker TKzeo-cDNA saknar ett mål för miRNA av intresse. Riktad cDNA kan isoleras genom PCR-amplifiering av DNA från celler som överlever ganciklovir med primrar som flankerar cDNA och PCR-produkter kan sekvenseras för att identifiera mål. Vi har utvecklat Kings College teknik i ett nytt verktyg för global identifikation och upptäckt av funktionella mänskliga miRNA mål - uppdraget Target ID-bibliotek. Med målet ID-bibliotek, kan användare isolera miRNA mål genom en serie av däggdjur cellodling transfektion och drog stegen urval. Biblioteket är omfattande och innehåller 66-79% av mänskliga gener. Initiala resultat indikerar att både tidigare upptäckt och nya mål kan isoleras från beskickningen Målidentiteten bibliotek. Även om protokollet är av viss längd,användning av Target ID-bibliotek kräver vanliga molekylära lab tekniker - däggdjursceller kultur, transfektion, läkemedel urval, PCR och sekvensering - och därför bör vara väl inom de medel de flesta biologer. Vi föreslår att tillräcklig uppmärksamhet ägnas åt lämplig experimentell design, optimering odlingsbetingelser, och viktigast av allt, pre-test varje ny celltyp för att bestämma optimala läkemedelsnivåer vid urvalet stegen (kill-kurvor) för att säkerställa framgång med målet ID-bibliotek. Som med alla miRNA mål identifieringsmetoder, är det starkt rekommenderat att målen identifierats genom screening biblioteket Target ID kan valideras med en andra metod, såsom microarray, QRT-PCR, reporter analys (dvs. luciferas) eller Western analys.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq färdigblandat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciklovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute genomiska däggdjurs-DNA Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Cellspecifik Nucleofection kden </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Mål ID-bibliotek </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen for mirna targets using the mission target id library

Target ID-bibliotek är utformad för att hjälpa till upptäckt och identifiering av mikro-RNA (miRNA) mål. Target ID-bibliotek är en plasmid-baserad, Genomvid cDNA-bibliotek klonat in i 3&#39;UTR nedströms från dubbla valet fusionsprotein, tymidinkinas-Zeocin (TKzeo). Den första omgången av selektion är för stabila transformanter, följt av införande av en miRNA av intresse, och slutligen, selektering med avseende på cDNA-sekvenser innehållande miRNA mål. Valda cDNA identifieras genom sekvensering (se figur 1-3 för Target ID-bibliotek arbetsflöde och detaljer). För att säkerställa en bred täckning av den mänskliga transkriptom var Target ID-bibliotek cDNA genereras via oligo-dT priming med en pool av totalt RNA framställt från flera mänskliga vävnader och cellinjer. Resulterande cDNA intervallet från 0,5 till 4 kb, med en genomsnittlig storlek av 1,2 kb, och klenades in i p3TKzeo dubbla selektion plasmiden (se figur 4 för plasmid karta). De genmål representerade i litek kan hittas på Sigma-Aldrich hemsida. Resultaten från Illumina sekvensering (tabell 3), visar att biblioteket innehåller 16.922 av de 21,518 unika gener i UCSC RefGene (79%), eller 14.000 gener med 10 eller flera läsningar (66%).

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library at JoVE.com

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Target ID-bibliotek är en plasmid-baserad, genomet hela samling av klonat cDNA används för att identifiera miRNA mål. Här visar vi dess användning och tillämpning.

Genome-wide screen för miRNA Mål Använda MISSION biblioteket Target ID

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Genomvid Analys av Aminoacylation (laddning) Nivåerna av tRNA Använda Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomvid Analys med hjälp av chip för att identifiera isoform-specifik gen mål

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

UPPDRAG LentiPlex Poolade shRNA Bibliotek Screening i däggdjursceller

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Kvantitativa och automatisk hög genomströmning Genomvid RNAi skärmar i C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesian Change-punkt Algoritm för Genomvid analys av olika ChIPseq datatyper

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletioner i<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Av High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Upptäckt av miRNA mål i hög kapacitet Använda 3&#39;LIFE analys

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomvid Kartläggning av narkotika DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tvärbindning av små molekyler att isolera Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Genomvid Rening av extrakromosomala cirkulär DNA från eukaryota celler

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Heltäckande arbetsflöde för Genome-wide identifiering och uttryck Meta-analys av ATL E3 Ubiquitin Ligase gen familjen i Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...