Name: genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)
Uploaded: 2012-06-14T12:00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs at JoVE.com

1. Нестандартная конструкция ZFN процесс <ol><li> Для ускорения процесса проектирования ZFN, следователь должен обеспечить: </li><ul><li> Информация о гена-мишени, такие как ген имен, видов и генной аннотации / идентификационный номер. </li><li> Четко указано на-все цели эксперимента (например, нокаутом или Knockin) </li><li> Любые конкретные факторы гена-мишени, которые включают атипичные структуры генов, специальные биологии вовлечены в генетический локус, или гомологичными регионами других в геноме. </li><li> Конкретный выбор последовательности ДНК для цинка пальца нуклеазы целевой. </li></ul><li> Команда Sigma биоинформатики проводит в дизайне кремний ZFN развивать первоначальный сайтов пальцем цинка цели. </li><li> Начальные участки целевой ZFN предоставляются ZFN научно-технического консультанта. Для более технически сложных проектов, этот ученый Sigma работает со следователями по разработке проекта стратегии. </li><lя&gt; команда Sigma биоинформатики проводит анализ ZFN алгоритмы для генерации в кремнии конструкций ZFN. Это включает в себя целый геном поиска для офф-целевые сайты, повторите маскировки, и SNP анализа для каждого потенциального сайта целевой ZFN. </li><li> Биоинформатика дает лучшие сайты целевой ZFN к следователю для ознакомления. После утверждения потенциальных объектов целевой ZFN, эта информация содержится в команде Производство ZFN начать ZFN производственного процесса. </li></ol> 2. Пользовательские Производство ZFN <ol><li> Архив Sigma цинка модулей палец используется для сборки утвержденными проектами ZFN. </li><li> Каждый дизайн ZFN собран и последовательности проверить на высокой платформе клонирование пропускной способности. </li><li> После производства все проекты ZFN завершится каждый ZFN отправляется на проверку. </li></ol> 3. Проверка пользовательского ZFNs <ol><li> ZFN проектовчеловека, мыши, крысы или СНО видов подтверждены в хорошо изученных клеточных линий для каждого вида дрожжей на основе анализа используется для других организмов или типа клеток. </li><li> ZFN конструкции поставляются в соответствующей строке ячейки nucleofection и ZFNs выражены. </li><li> ДНК собирают из пула ZFN трансфицированных клеток и область интересов ПЦР усиливается. </li><li> Cel-1 тест Затем проводится на ПЦР-продукт. Гель-электрофорез проводится на Cel-1 тест на проверку ZFN деятельности. </li><li> Самая высокая проектная деятельность ZFN что подтверждается Cel-1 тест затем передается клиенту. ZFNs поставляются в РНК и ДНК плазмиды, а также ПЦР-праймеров для Cel-1 и анализ геномной ДНК в качестве положительного контроля. </li></ol> 4. Доставка Утвержденные ZFNs по Nucleofection <ol><li> Семенной клеток с плотностью 2x10 5 клеток / мл в день до nucleofection. </li><li> В день nucleofection,вынуть сотовый линии Nucleofector Kit V и пусть прогреть до комнатной температуры. </li><li> Добавить дополнение к Nucleofection Решение V в соответствии с протоколом производителя. </li><li> Подсчитайте клеток. Плотность клеток должна быть в пределах 2,5-5x10 5 клеток / мл. </li><li> Заполнить 6-луночный планшет с 2 мл среды в каждую лунку и предварительно тепло СО 2 инкубатор при 37 ° С, по крайней мере за 20 минут до nucleofection. </li><li> Центрифуга 2x10 6 клеток на трансфекции (8x10 всего 6) в 200xg течение 5 минут. </li><li> Промойте клетки в два раза по 20 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS). </li><li> Подготовка экспериментального труб: (см. таблицу в пользовательских бюллетень ZFN технические) </li><li> Удалите 6-и пластины, содержащей средства массовой информации, начиная с шага (6.5) из инкубатора. </li><li> Ресуспендируйте клеток в 400 мкл (100 мкл / реакция) Nucleofection решение В. </li><li> Одной из реакций на время, добавьте 100 мкл клеток в каждой ДНК или РНК-содержащих трубки. Transfэ смесь до 2 мм электропорации кюветы и nucleofect на Nucleofector с соответствующей программой. </li><li> Сразу же после nucleofection каждого образца, использовать передачу пипетки добавить ~ 500 мкл подогретую среду от 6-луночный планшет в действии (6.9) в кювете. Затем аккуратно переносить клетки из кювета на оставшиеся подогретую среду в 6-луночного планшета. </li><li> Завершить все реакции и вернуть 6-луночного планшета для CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C. </li></ol> 5. Сбор геномной ДНК после доставки ZFNs <ol><li> 6-луночного планшета - не собрать всех объединенных ячеек. Важно сохранить культуру, чтобы иметь клеток одного клона клеток после разведения Вы подтверждаете, что у вас есть Cel-1 пищеварения продукты. От одного до трех дней после nucleofection собирать клетки для подготовки хромосомной ДНК с использованием GenElute млекопитающих геномной ДНК Miniprep Kit. </li></ol> 6. Cel-1 Пробирной </р&gt; <ol><li> ПЦР усилить геномной ДНК из ZFN трансфицированных образцы и положительные геномной ДНК контроля, предусмотренных в комплект, с помощью прилагаемого праймеров. ПЦР установлена ​​с соблюдением следующих условий: (см. таблицу в пользовательских бюллетень ZFN технический). </li><li> Для создания гетеродуплексов от homoduplexes ПЦР принимают по 10 мкл ПЦР-реакции от каждого ZFN рассматривать образец плюс контроль и использовать следующие программы Термоциклер: 95 ° C, 10 минут 95 ° C до 85 ° С, -2 ° C / сек 85 ° C до 25 ° С, -0.1 ° C / сек 4 ° C, на неопределенное время </li><li> Добавить 1 мкл усилителя и 1 мкл нуклеазы S (от Transgenomic Номер в каталоге 706025) для каждой реакции и инкубировать при 42 ° С в течение 20-40 минут. </li><li> Запустите пищеварения на 10% PAGE-КЭ геля с соответствующей маркеров, таких как DirectLoad WideRange ДНК Ladder (Номер в каталоге D7058) (см. результаты в пользовательских бюллетень ZFN технический). </li><li> Насе позитивный сигнал был обнаружен в ZFN обработанных популяций чел-я пробы, приступить к клональной выделение и характеристика. </li></ol> 7. Клональный Выделение и характеристика <ol><li> Одноклеточный клон ZFN обработанных образцов стандартных методов, включая FACS и разбавления клонирования. </li><li> Позвольте клонов расширить достаточно, то разделить определенную долю клеток для геномной ДНК урожай, замораживание назад остальное, как в банке материалов. </li><li> Усиление геномной ДНК из клонов использованием Cel-я грунтовки и анализа ампликонов на Cel-я анализа (с учетом и без WT ДНК шипами в), или же использовать этот ампликона перейти непосредственно к генотипирования. </li><li> Клоны Генотип кандидата определены как раз редактировалось аллелей по предпочтительным методом. </li></ol> 8. Представитель Результаты Например всего CompoZr ZFN рабочего процесса представлены на рисунке 2. ZFNs поставляютсяв клетках, где они связываются и прилепится соответствующие последовательности ДНК, которая создает двухцепочечной брейк (DSB). Естественный процесс ремонта, негомологичными конца соединения (NHEJ), ремонт DSB. В некоторых случаях аномальным результатам в NHEJ удаления, вставки или замены нуклеотидов. ПЦР-амплификации собраны результаты геномной ДНК в формировании гетеродуплексной между дикого типа и изменение ампликонов после денатурации / отжига реакции ПЦР. Добавление Cel-1 фермента приводит к расщеплению любой гетеродуплексной молекул. Cel-1 результатов решаются PAGE анализ, чтобы подтвердить ZFN расщепления. На рисунке 3 представлен схематический Cel-1 и анализ ожидаемых результатов. Представитель Cel-1 результатов, содержащихся в рисунках 4 и 5 Рисунок 4 содержит результаты очень активная пара ZFNs (21%) в клетках К562;. На рисунке 5 представлены результаты с менее активной пары (2,4%) в ZFNsК562. ZFN деятельности подтверждается и цифрами наличие двух фрагментов ПЦР ниже родительского фрагмента ПЦР. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Представление связанных нуклеазы пальцем цинка. ZFNs разработаны белки состоят из цинкового пальца ДНК-связывающим доменом слит с расщеплением области рестриктазы FokI. При привязке как гетеродимер, ZFNs создания двухцепочечной перерыв в указанной пользователем последовательности ДНК. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Схема пользовательского Workflow Service ZFN. Графическое представление рабочего процесса, чтобы создать генетически модифицированные клетки линии с помощью CompoZr ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Схема Cel-1 и анализ результатов.) ZFN плазмиды о<html> Г мРНК доставляется к клеткам. B) выразил ZFNs связывают и сократить целевой последовательности создания двухцепочечной перерыва (DSB) в части клеток. C) Aberrant ремонт некоторых ДР по негомологичными закончить присоединение приводит к нуклеотидные вставки или удаления. D) геномной ДНК собирают из трансфицированных пула клеток и усиливается в локусе интерес. EF) ПЦР-продукта является денатурированным и повторно отжигали создания гетеродуплексной формирование между дикого типа и изменение ампликонов. G) Cel-1 несоответствия эндонуклеазы результатов анализа в расщеплении гетеродуплексной молекул. H) Cel-1 фермент переваривает решаются PAGE. Наблюдаемое соотношение расщепления продуктов для парентерального группа, определяется ImageJ программного обеспечения, указывает на сокращение доли и эффективности ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. Cel-1 результатов с 21% активных ZFNs ImageJ программное обеспечение доступно.:_blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Рисунок 5" /> Рисунок 5. Cel-1 результатов с 2,4% активного ZFNs ImageJ программное обеспечение доступно по адресу:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

<ol>
	<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+restriction+enzymes:+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain.">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li><li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases.">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).</li><li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases.">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433 (2009).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li><li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).</li><li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases.">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li><li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption.">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li></ol>

Исследователи могут обеспечить ZFN модифицированные клетки или животные сотрудников по стандартным лицензионным соглашением исследований. В таком случае Sigma просит соглашение о передаче материала помещают в место между Sigma, клиент ZFN и их сотрудником. Исследование лицензии можно ознакомиться на сайте: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . Если есть потенциал для коммерческого приложения с помощью модифицированных клеток ZFN Sigma затем просит Коммерческая лицензия ставится на место. Производство и свободного доступа к этой статье спонсируется Sigma, Inc

После ZFN модифицированные клетки выделяют у них постоянные и наследственные ДНК модификации. В результате способность генерировать устойчиво изменение клеточной линии или породы животных с заданными генетическими модификациями, чтобы провести исследования. CompoZr пользовательских ZFNs обеспечивают надежный метод для редактирования генома в самых различных типов клеток. Публикация генома успешного редактирования с ZFNs включает, но не ограничиваясь клеточных линий человека, мыши, крысы, данио, лягушку, свиней и модели СНО исследований. 3,4,5,6,7,8,9 возможность создания двухцепочечной перерыв в нужной целевой сайт в указанный тип клеток обеспечивается при ZFNs правильно доставлен в камеру. Кроме того, можно выполнять последовательные изменения пальцем цинка в камеру для того, чтобы иметь более одной генетической модификации в ячейке 10. Возможность выбора определенной последовательности целей и изменить только данного локуса является основной причиной для возможности создания нескольких модификацийкатионов. CompoZr пользовательских ZFN сертификат анализа генерируется очень реагенты в комплект таким образом гарантируя, что все компоненты набора были тщательно проверены для успеха клиента. Критические этапы рабочего процесса от начала до конца, представлены ниже: Сотовые клонирования Способность изолировать и расширение данной клеточной линии должны быть проверены перед началом любого ZFN экспериментов. Отдельные клетки должны быть изолированы и расширена, чтобы клонально производных населения возможно. Некоторые клетки линии непокорных в этом вопросе, и трюки, такие как обогащение редактировалось клонов, или культуры с условным СМИ могут помочь в преодолении этих проблем. Доставка эффективность Оптимизация доставки эффективности является обязательным до сдачи ZFNs. Многие методы могут быть использованы в том числе на основе липидов трансфекции, электропорации, и nucleofectiо. Идеальный метод доставки состоит из одного, что обеспечивает наиболее оптимальное сочетание эффективности доставки и выживаемости клеток. Количественного эти эффективность может быть оценена путем предоставления GFP контрольной плазмиды и количественного путем визуального осмотра или FACS 24-48 часов после родов. Cel-I анализ Крайне важно, чтобы Cel-I анализ проводится параллельно с соответствующим контролем, чтобы ПЦР, пищеварение и электрофорез параметров не будет вмешиваться в интерпретации эксперимента ZFN. Каждый комплект включает в себя контроль геномной ДНК, которые используются для создания Cel-I изображение в сертификате анализа. Усиление контроля с ДНК с праймерами при условии последующей Cel-I анализ позволит пользователям сравнить результаты, которые содержатся в сертификате анализа (COFA) изображение, и изолировать любую потенциальную неэффективность в этом плане эксперимента. Соответствующие отрицательного контроля, такие как макет, или GFP обработанной клеткиобразцы также должны быть включены, чтобы выяснение любого не конкретные продукты расщепления. Качественный / Количественный анализ одно-клеточных клонов После ZFN лечения и одного клонирования клетки, популяции клеток могут быть показаны для редактирования в локусе интерес целый ряд методов. Cel-я анализ может быть проведен на геномной ДНК из клонов с целью выявления кандидатов клоны для дальнейшего генотипирования. Важно, чтобы шип WT ПЦР ампликона в образец ампликонов в соотношении 1:1 перед выполнением Cel-я переварить как гомозиготных мутантных клонов будет содержать однородные молекулы, и, следовательно, передать отрицательное Cel-я анализа результатов. Альтернативный метод для скрининга этих кандидатов клонов проектировать одну ПЦР праймер посадку прямо на сайте целевой ZFN. Используется в сочетании с одной из управляющих грунтовки, отрицательный результат теста указывает потеря WT последовательности. Гетерозиготных клон, содержащий хотя бы одну WT аллели у,ield ПЦР сигнал, но могут быть полностью отделены от WT клонов выполнения ПЦР в контексте SYBR КПЦР. Как только кандидат клонов были определены эти методы, они могут быть генотипировали стандартными пиросеквенирования, глубокое секвенирование, или другие методы секвенирования. Для всех методов секвенирования, ампликона создан из клональной геномной ДНК должны быть получены. Для традиционных аллелей пиросеквенирования могут быть отделены от TA-клонирования продуктов ПЦР и секвенирования отдельных колоний. Для таких методов, как глубоко последовательности этот шаг не является необходимым. Гомология Режиссер Ремонт (HDR) Этот протокол обеспечивает метод ZFN опосредованное нокаут гена через NHEJ. Интеграция трансгенов может быть проведено путем введения доноров плазмиды с оружием, что гомологии фланге сайт ZFN разреза. 11 В этом сценарии, созданные ZFN двухцепочечной разрыв ремонт HDR вместо NHEJ. HDR направленных яntegration трансгенов может быть подтверждена с помощью подобных методов к процедурам, предусмотренным в настоящем протоколе. Поиск и устранение неисправностей Доставка ZFNs Доставка ZFN и выражения доставки можно управлять для поставкой GFP или другие подобные плазмиды для визуализации и / или количественный. Низкий выражение в связи с несовместимостью с промоутером типа клеток интерес может быть преодолена путем доставки ZFNs в мРНК формате. Кроме того, методом холодного шока могут быть использованы для дальнейшего повышения эффективности ZFNs в клетках. 12 Если мРНК используется крайне важно, чтобы клетки промывают до родов, чтобы обеспечить все сыворотки производных РНКазы были удалены. Разумно также таять мРНК на льду, и добавить его к клеткам в самый последний момент, чтобы свести к минимуму любую возможность для деградации. Cel-I анализ Основой Cel-я ассау есть конкретные и достаточно усиления локус интерес. Если не конкретные продукты усиление наблюдается использовать стандартные ПЦР устранения неисправностей увеличения специфичности, таких как оптимизация количества шаблонов, грунтовки концентрации, и езда на велосипеде параметров. Выполните PAGE анализ в отличие от стандартных электрофореза в агарозном как последний метод не обеспечивает адекватного разрешения и чувствительности. Cel-я дайджест условия могут быть оптимизированы, если не переваривается продукт или чрезмерное размытие не наблюдается. Титрование суммы Cel-1 нуклеазы и / или длина пищеварения время можно титровать, чтобы улучшить эти аспекты.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Нуклеазы S (Cel-1 ферментов) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Развернуть High Fidelity PCR System </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Сотовые линии Nucleofector Kit V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP эндотоксина-Free Плазмиды Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs at JoVE.com

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

CompoZr пользовательских цинк-Finger нуклеазы (ZFN) Сервис позволяет точного редактирования генома любого организма или клеточной линии в любой локус определяется пользователем. В этой статье описывается процесс проектирования, изготовления, проверки и реализации службы CompoZr пользовательских ZFN.

Геном Редактирование с помощью пользовательских CompoZr нуклеаз цинкового пальца (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

Гросс и изобразительных Препарирование Внутреннее ухо Сенсорные эпителия у взрослых данио рерио ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

Тактильные Автоматизированная Пассивно-Finger Стимулятор (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Измерение Neuromagnetic функции мозга в Дети дошкольного возраста с настраиваемыми Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

Выполнение пользовательских Эксперименты Microarray микроРНК

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Мышь Геном Инжиниринг Использование конструктора нуклеаз

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Цинк-палец Nuclease Enhanced генного таргетинга в человеческих эмбриональных стволовых клеток

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Прямая белка Доставка клетках млекопитающих, используя сотовый проницаемым Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Его<sub&gt; 2</sub&gt; Цинк пальцев Домены

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Геном Редактирование в<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Использование Транскрипция Активатор-как эффектор Нуклеазы (Таленс)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Оценка минеральной доступности в кормах для рыб с использованием дополнительных методов, продемонстрированная на примере цинка в атлантическом лососе

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Молчание Spark: CRISPR/Cas9 Редактирование генома в слабо электрической рыбы

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...