Name: changing the direction and orientation of electric field during electric pulses application improves plasmid gene transfer in vitro
Uploaded: 2011-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro at JoVE.com

Detta arbete stöddes av det slovenska forskningsinstitut (projekt J2-9770, infrastrukturella centrum IP-0510 och program P2-0249). Denna video är kompletterande material för &quot;elektroporation-baserade tekniker och behandlingar&quot; vetenskapliga verkstad och magisterexamen, som anordnas av fakulteten för elektroteknik vid universitetet i Ljubljana, Slovenien. Författarna tackar också Duša Hodzic för snällt att ge plasmid-DNA.

1. Cellodling, plasmid och buffert förberedelse för försöket <ol><li> I detta experiment kinesisk hamster celler (CHO-K1) används. Celler odlas i en näringslösning blandning HAM-F12 (PAA) kompletterat med 2 mm L-glutamin, 10% fetalt bovint serum, 400 l / l gentamicin (alla från Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Tyskland) och 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagreb, Kroatien). Cellerna hålls vid 37 ° C i en fuktig 5% CO 2 atmosfär i inkubator för 24h. </li><li> Förstärk plasmid pEGFP-N1 (Clon...

<ol>
	<li>Rebersek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporator+with+automatic+change+of+electric+field+direction+improves+gene+electrotransfer+in-vitro.">Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro.</a> Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).</li><li>Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip+electrode+chamber+for+small+volume+electroporation,+electrofusion,+and+gene+transfection.">Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection.</a> 18, (2006).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-841 (1982).</li><li>Daud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+trial+of+interleukin-12+plasmid+electroporation+in+patients+with+metastatic+melanoma.">Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).</li><li>Pavlin, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+conductivity+of+a+suspension+of+permeabilized+cells:+a+theoretical+analysis.">Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis.</a> Biophys J. 85, 719-729 (2003).</li><li>Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+mechanisms+of+electric+field-induced+DNA+transfection.+IV.+Effects+of+DNA+topology+on+cell+uptake+and+transfection+efficiency.">Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency.</a> Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).</li><li>Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+electrotransfection+of+mammalian+cells.">Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).</li><li>Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+synchronization+effect+on+mammalian+cell+permeabilization+and+gene+delivery+by+electric+field.">Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field.</a> Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).</li><li>Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Mg+ions+on+efficiency+of+gene+electrotransfer+and+on+cell+electropermeabilization.">Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization.</a> Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).</li><li>Rols, M., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electropermeabilization+of+mammalian+cells+to+macromolecules:+control+by+pulse+duration.">Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration.</a> Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).</li><li>Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+involved+in+gene+electrotransfer+using+high-and+low-voltage+pulses-An+in+vitro+study.">Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study.</a> Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).</li><li>Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+electrophoresis+in+gene+electrotransfer.">The role of electrophoresis in gene electrotransfer.</a> J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).</li><li>Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+electrode+orientation+improves+the+efficacy+of+electrochemotherapy+of+solid+tumors+in+mice.">Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).</li><li>Faurie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mediated+gene+transfer+and+expression+are+controlled+by+the+life-time+of+DNA/membrane+complex+formation.">Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation.</a> J Gene Med. 12, 117-125 (2010).</li></ol>

Gene electrotransfer är en mångsidig bioteknik teknik som möjliggör överföring av DNA i celler genom att tillämpa korta, högspänning elektriska pulser 3 och är ett säkrare alternativ till virala vektorer på grund av dess säkerhet, effektivitet och enkel applikation. Även om dagens gen electrotransfer används ofta för att transfektera alla typer av celler och den första fas I klinisk studie med denna metod har rapporterats 4, är de bakomliggande mekanismerna ännu inte helt klarlag...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> HAM-F12 </td><td> PAA </td><td> E15-016 </td><td> odlingsmedium </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> fetalt bovinserum </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> gentamicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td> antibiotika </td></tr><tr><td> crystacilin </td><td> Pliva </td><td> 625.110 </td><td> antibiotika </td></tr><tr><td> pEGFP-N1 </td><td> Clontech Laboratories </td><td> 6085-1 </td><td> plasmid-DNA </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12.662 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Merck </td><td> F640786 933 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> TKI Hrastnik </td><td> 0795 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-8266 </td><td></td></tr><tr><td> sackaros </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 16.104 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA-lösning </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4174 </td><td></td></tr><tr><td> pipettspetsen </td><td> Skräddarsydda </td><td></td><td></td></tr><tr><td> elektrisk pulsgenerator </td><td> Skräddarsydda </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 brunnar </td><td> TPP </td><td> 92.406 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml centrifugrör </td><td> TPP </td><td> 91.015 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 kulturen kolv </td><td> TPP </td><td> 90.076 </td><td></td></tr></tbody></table>

changing the direction and orientation of electric field during electric pulses application improves plasmid gene transfer in vitro

Gene electrotransfer är en fysisk metod som används för att leverera gener in i cellerna genom tillämpning av korta och intensiva elektriska pulser, som orsakar destabilisering av cellmembranet, vilket gör det släpper igenom små molekyler och möjliggör överföring av stora molekyler som DNA. Det representerar ett alternativ till virala vektorer, på grund av dess säkerhet, effekt och enkel applikation. För genen electrotransfer olika elektrisk puls protokoll används för att uppnå maximal gen transfektion, en av dem håller på att förändras det elektriska fältet riktning och orientering under pulsen leverans. Ändra elektriska fältet riktning och orientering öka membranet området behöriga för DNA in i cellen. I denna video visar vi skillnaden i genen electrotransfer effekt när alla pulser levereras i samma riktning och när pulser levereras genom att ändra alternativt elektriska fältet riktning och orientering. För detta ändamål spets med integrerad elektroder och högspännings-prototyp generator, som möjliggör byte av elektriska fält i olika riktningar under elektrisk puls ansökan, har använts. Gene electrotransfer effekt bestäms 24h efter puls ansökan som antalet celler som uttrycker grönt fluorescerande proteinet dividerat med antalet av alla celler. Resultaten visar att genen transfektion ökas när det elektriska fältet läggning under elektrisk puls leverans ändras.

Watch this Scientific Journal Video about Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro at JoVE.com

Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro

Gene transfektion av elektroporation förbättras ungefär två gånger när orientering av elektriska fält ändras under pulsen ansökan, medan cellviabiliteten inte påverkas. Ökningen av genen transfektion orsakas av ökningen av membranet område som är gjord behörig för DNA in i cellen.

Ändra riktning och orientering Electric Field Under elektriska pulser Ansökan Förbättrar Plasmid genöverföring In vitro</em

Gene electrotransfer is a physical method used to deliver genes into the cells by application of short and intense electric pulses, which cause ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Fastställande och spridning av mänskliga Retinoblastom Tumörer i Immune deficienta möss

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Genöverföring för ischemisk hjärtsvikt I en preklinisk modell

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Tillämpningen av permanenta Mellanöstern Cerebral Artery Ligation i musen

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion och Detektering av reaktiva syreradikaler (ROS) i cancer

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkörer i en djurmodell för att avslöja Neurala, Hematologiska och Behavioral korrelat till PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Islet Bildning i Lever från diabetiska möss genom Helper-beroende adenovirusvektor genöverföring

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

Kärl Gene Transfer från Metallic Stent Ytor Använda adenovirusvektorer Tethered genom hydrolyser tvärbindare

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gene Transfer Teknik och<em&gt; In vitro</em&gt; cellbaserade analyser för studier av benförlust i belastningsskador

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Mikroskopi datorbaserade metoder för bedömning av epitelial cellmigration under In Vitro sårläkning

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...