Name: genplat: an automated platform for biomass enzyme discovery and cocktail optimization
Uploaded: 2011-10-24T13:00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization at JoVE.com

Эта работа была частично финансируется министерством энергетики США Великие Озера биоэнергетики Научно-исследовательский центр (DOE Управления науки BER DE-FC02-07ER64494) и грант DE-FG02-91ER200021 от Министерства энергетики США, Управление основной энергии наук, отдел химических наук, наук о Земле и биологических наук. Мы благодарим Джона Скотта-Крейг и Мелисса Borrusch для их материального и концептуального вклада.

1. Фермент производства <ol><li> Продукция белков в Pichia pastoris путем клонирования соответствующих генов в векторы pPICZ или pPICZα и превращения в П. pastoris. Рост клеток в 300-мл партий в тупик 500-мл колбы с метанолом индукции каждые 24 ч (Банерджи и соавт., 2010a). </li><li> Концентрат и опреснения культуры фильтратов по тангенциальной фильтрации потока. </li><li> Магазин ферменты в небольших порции в 20% глицерине при -80 ° C. Диапазон концентраций составляет 1-10 мг / мл. </li></ol> 2. Планирование эксперимента <ol><li> Введите число ферментов, чтобы быть проверены, их верхние и нижние пропорции (например, меньшая доля в размере 5% для основных ферментов), и тип экспериментального проектирования (например, квадратичной или кубической) в дизайн-Expertsoftware. </li><li> Рассчитать сумму в мкг каждого фермента, которые будут добавлены, чтобы общая нагрузка от 15 мг / г глюкан, а затем вычислить количество каждого фермента в мкл, чтобы добавить ккаждой реакции. </li><li> Создание листов Excel указанием источника лабораторного оборудования, источник скважин, назначение лабораторного оборудования, назначение скважин, и передача объемов для дозирования воды и ферментов в соответствии с опытно-конструкторских и импортировать его в программное обеспечение Biomek FXP использованием трансфертного из-файл функции. </li></ol> 3. Ферментативного гидролиза <ol><li> Приостановить биомассы суспензии в 50 мМ цитрат натрия, рН 4,8, содержащий 5 мкг / мл тетрациклина и 5 мкг / мл циклогексимид, в весла водохранилище. </li><li> Робота пипетки 200 мкл раствора в каждую лунку 96-луночного глубоких скважин пластин реакции с помощью Span-8 1000 мкл пипетки советы с последними 0,5 см отрезать. Смешайте суспензии один раз в 100 мкл / сек, а затем аспирата же объемом от весла водохранилища и обойтись в пластинах. </li><li> Внесите ферментов в одной тарелке с помощью программы вступил в Beckman FX. </li><li> Уплотнение пластин с pierceable capmats. </li><li> Обратить и нажмитепластин несколько раз, чтобы преодолеть поверхностное натяжение. Место пластин при 50 ° С в течение 48 ч в гибридизация инкубатора вращающихся в 10 оборотов в минуту. </li></ol> 4. Определение Glc и XYL <ol><li> Центрифуга реакция пластины в течение 3 мин при 1250 мкг в размахивая ведром центрифуги. </li><li> Передача 100 мкл надосадочной в обычную 96-луночных использования AP96 стручок Biomek FX. </li><li> Инкубируйте пластин при 90-95 ° С в течение 10 минут для того, чтобы инактивировать ферменты, а затем центрифуге при 1250 мкг в течение 30 сек. </li><li> Для измерений Glc, передача 12 мкл супернатанты в регулярные 96-луночных планшетах. Добавить 192 мкл глюкозооксидазы / пероксидаза (GOPOD) реагента. Инкубируйте пластин при 50 ° С в течение 20 минут и прочитать абсорбции при 510 нм в микропланшетного. Бланк является реакционной смеси без каких-либо фермента. </li><li> Для XYL измерения, передачи 4 мкл в 384-луночных планшетах. Добавить анализа реактивов и читать пластин при 340 нм. Пустойявляется реакционной смеси без каких-либо фермента. </li></ol> 5. Анализ данных <ol><li> Преобразование значения абсорбции их Glc% и XYL урожайности на основе известных Glc и XYL содержимое исходного биомассы. Импорт эти проценты, как ответы на дизайн-эксперт программного обеспечения. Проверка статистических paramenters быть уверены, что критерии для надежной модели выполнены. </li><li> Подтвердить лучшую модель предсказания экспериментально. </li></ol> 6. Представитель Результаты с GENPLAT: (1) Создание оптимизированных смесей отдельных чистых белков. Результаты показывают, которых ферменты важны, и в каких пропорциях, а также ферменты, которые не являются важными. Некоторые белки, которые имеются в изобилии в Т. reesei secretome (Nagendran и соавт., 2009), такие как Cip1 и Cip2, как представляется, не играют никакой роли в Glc освобождения из кукурузы Стовер предварительно обработанных аммиаком волокна расширения (AFEX) или щелочных гидравлические<html> Роджен перекись (АХП) (Банерджи и соавт., 2010b). С другой стороны, некоторые белки неожиданно важно. Например, эндо-ксиланазы гликозил семей гидролазы 10 и 11 являются важными для Glc релиз, один ксиланазы не может заменить другие (Банерджи и др., 2010b, с.). Cel61A, незначительных белка в Т. reesei secretome, что очень важно для Glc но не XYL релизе. Некоторые ферменты важны для выпуска как Glc и XYL, тогда как другие необходимы только для одного или другого (Банерджи и соавт., 2010C). Синтетическая смесь, содержащая 16 компонентов, каждый в концентрации 0,94 мг / мл (то есть, не оптимизированной смеси), выпущенный 38% доступных Glc из-AFEX предварительно DDG. При одинаковых условиях гидролиза, оптимизированная смесь, в которой концентрация 16 компонентов в диапазоне от 0% до 32%, выпущенный 52% Glc (рис. 2). Этот эксперимент показывает, утилита построения определена смесей. _content &quot;&gt; (2) Создание оптимизированных для различных коктейлей предварительной обработки / субстрат комбинаций. Текущий коммерческих препаратов целлюлозы являются« один размер подходит всем &quot;. На самом деле, лучший коктейль зависит как от субстрата и предварительной обработки. единого продукта таких как Accellerase 1000 дает различные выходы из различных подложках предварительно таким же образом, и от одной подложке подвергаться различным предварительной обработки (рис. 1). Мы использовали GENPLAT для оптимизации смесей чистые ферменты для нескольких предварительной обработки и Mutiple сырья (Банерджи и др. др.., 2010C). Рисунок 2 показывает, как оптимальные пропорции фермента 16 чистых ферментов отличается для AFEX-предварительно кукурузы Стовер, АХП, предварительно обработанные кукуруза Стовер, и AFEX-предварительно DDG. Только 11 ферментов, показаны на рис. 2, так как оптимальное Пропорции другие пять (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 и Cel12A) оказались 0% (Банерджи и соавт., 2010C). (3) Новый фермент открытие </strОнг&gt;. Строительство оптимизированы смеси чистых белков представляет собой непрерывный процесс. По мере появления новых белков становятся доступными в чистом виде (из коммерческих источников, по гетерологичных выражение, или очищение), они могут быть систематически проверена путем добавления их в текущий оптимизированный набор. Новые белки, которые способствуют или Glc XYL релиз затем стать частью новой, оптимизированный набор. Таким образом, GENPLAT становится платформой для выявления новых ферментов для биомассы деконструкции. Мы сделали экстракты грибов, кроме Т. reesei и А. Нигер, выращенных на различных подложках. Один частности экстракт увеличила Glc выход, когда добавлен в наш основной набор. Ответственность белка очищали и показано, что роман гликозил гидролазы нет в любых коммерческих ферментного препарата (Банерджи и Уолтона, неопубликованные результаты). (4) Открытие лучше ферментов. Показав с GENPLAT которых ферменты являются наиболее важными для деградациичастности биомассы, у нас есть лучшее понимание того, какие ферменты должны быть в центре внимания для улучшения. Лучше примеры критических ферменты могут быть найдены с помощью функции поиска в природе или с помощью белковой инженерии. (Фермент может быть &quot;лучше&quot;, чем его Т. reesei гомолога несколькими способами, в зависимости от желаемого имущества, например, более высокую удельную активность, более тесного взаимодействия, снижение протеолитических чувствительности или повышенной термической стабильности). GENPLAT обеспечивает значимые платформой для опробования потенциально лучше ферменты, потому что она использует реально сложный коктейль (не важно, потому что биомасса фермент работает в изоляции) и реалистичной подложки (важно, потому что результаты с чистой целлюлозы или другие искусственные субстраты, не могут иметь отношение к природным лигноцеллюлозных материалов). (5) Коммерческая оптимизация фермента. Достаточно большое количество чистые ферменты еще не существуют в реальном мире. Пока они не делают, про этанолизводителей должны полагаться на коммерческие продукты, такие как Accellerase 1000 и MultifectXylanase. Тем не менее, смесей промышленных ферментов, как правило, выполняют лучше, чем любой человек один, и GENPLAT может быть использована для разработки оптимизированного коктейли из нескольких коммерческих ферментов. На рисунке 3 показано использование GENPLAT оптимизировать смесь четырех коммерческих ферментных препаратов. Оптимальные пропорции для выпуска Glc из-AFEX предварительно DDG были признаны 47% Accellerase1000, 27% Multifect пектиназа, 22% Novozyme 188, и 4% Multifect ксиланазы (Банерджи и соавт., 2010C). Рис 3B показывает различия в Glc выход из AFEX-DDG с четырьмя ферментных препаратов; оптимизированы коммерческих целях смесь дает более высокий урожай, чем Glc Accellerase1000 один, SpezymeCP в одиночку, или 16-компонентов синтетические смеси. Этот эксперимент также показывает, что 16-компонентов синтетических смесь отсутствует один или несколько ферментов, необходимых для оптимального Glc релиз, в котором присутствуют в одной или нескольких коммерческих ферментов. GENPLAT может быть намред идентифицировать такие компоненты. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. Ни один из коммерческих ферментного препарата является оптимальной для всех субстратов и все предварительной обработки. Пять субстратов и три предварительной обработки были сравнены в аналогичных условиях шлифовальных (0,5 мм размером частиц), фермент загрузкой (15 мг / г глюкан), гидролизный условия (48 ч, 50 ° С). А. Переваривание различных AFEX-предварительно субстратов с Accellerase 1000. Б. Пищеварение кукурузы Стовер предварительно обработанные с помощью трех различных методов с Accellerase 1000 (см. Банерджи и соавт., 2010C). <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2. Оптимальные пропорции 11 ферментов для выпуска Glc из-AFEX предварительно кукурузы Стовер (AFEX-CS), щелочной перекиси водорода, предварительно обработанные кукуруза Стовер (МАИ-CS), или AFEX-предварительно высушенный дистиллироватьERS &#39;зерна (AFEX-DDG). Данные взяты из Банерджи и соавт. (2010C). Номера в верхней части бары Glc дает в процентах от общего Glc в биомассе образца. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="Рисунок 3"/> Рисунок 3. A. Использование GENPLAT производить оптимизированные смеси из четырех коммерческих ферментных препаратов для выпуска Glc из-AFEX предварительно DDG. Multifect ксиланазы сделали наименьший вклад (4%) и поэтому исключены из этой тройной диаграмме. Б. Glc урожайности AFEX-DDG с различными лечения фермента при одинаковых условиях гидролиза (15 мг / г глюкан фермента, 48 ч, 50 ° С) . &quot;Четыре-компонента коммерческих&quot; имеет пропорции определяются из эксперимента приведена на рис. 3А.

<ol>
	<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , (2007).</li><li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+enzyme+mixtures+for+biomass+deconstruction:+production+and+optimization+of+a+core+set.">Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set.</a> Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).</li><li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Bongers, M., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+multi-component+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+lignocellulosic+biomass.">Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass.</a> Bioresour. Technol. 101, 9097-9105 (2010).</li><li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+optimization+of+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+diverse+pretreatment/biomass+feedstock+combinations.">Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 22-22 (2010).</li><li>Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzyme+complexes+for+lignocellulose+hydrolysis.">Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).</li><li>Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+techniques+for+biomass+conversion.">High throughput screening techniques for biomass conversion.</a> Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).</li><li>Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+optimization+of+six+core+glycosyl+hydrolases+for+maximizing+saccharification+of+ammonia+fiber+expansion+(AFEX)+pretreated+corn+stover.">Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover.</a> Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).</li><li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61:+Structure+and+function+of+a+large,+enigmatic+family.">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li><li>Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factorial+optimization+of+a+six-cellulase+mixture.">Factorial optimization of a six-cellulase mixture.</a> Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).</li><li>King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microplate+assay+system+for+quantitative+evaluation+of+plant+cell+wall-degrading+enzyme+activity+of+fungal+culture+extracts.">An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).</li><li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera,+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei.">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li><li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates.">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Широко признано, что снижение стоимости ферментов важно развитие экономических лигноцеллюлозных промышленность этанола. В настоящее время доступны коммерческие коктейли фермента являются сложными и плохо определены смеси многих белков (Nagendran и соавт., 2009), и они приспособлены в основном для использования на кислотно-предварительно кукурузы Стовер. В целях ускорения разработки более совершенных коктейлей фермент, несколько лабораторий разработали высокой пропускной способности платформ для открытия ферментов и характеристики. Усилия в этой области, включили один или несколько из следующих свойств также в GENPLAT: робот дозирования ферментов и биомассы суспензий, статистический дизайн эксперимента, и / или автоматизированных определения Glc и XYL (Берлин и др., 2007; Decker и др.. др., 2009;. Ким и др., 1998;. Король и др., 2009).. GENPLAT расширяет эти более ранние усилия, что наиболее важно в сложности ферментом смеси, которые могут быть проанализированы с не более 6 компонентов вболее ранние исследования в более чем 16 в нашу последнюю работу (Банерджи и соавт., 2010C). Дополнительные ключевые особенности GENPLAT являются использование бусинка смесительной камеры (лопасть водохранилище), которые могут держать Стовер шламов приостановлены во время отпуска; нежный смешивания в процессе пищеварения до конца по сравнению с аналогичным конце вращения; и автоматизированных колориметрических определения Glu и XYL.

Оборудование и программное обеспечение, используемое: <ol><li> Дизайн-Эксперт программное обеспечение, версия 8.0 (Stat-Ease, Inc, Minneapolis, MN) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li> Biomek FXP лаборатории автоматизации рабочих станций (Beckman Coulter-, Фуллертон, Калифорния) </li><li> Biomek FXP программное обеспечение, версия 3.3 (Beckman Coulter-, Фуллертон, Калифорния) </li><li> Водный резервуар (В. П. Модель 756C-1P100, V &amp; P Научно Inc, Сан-Диего) </li><li> Плиты, 96-глубокая (1,5 мл) и (Abgene, Fisher Scientific, Epson, Великобритания) </li><li> Pierceable capmats (США Научные, Ocala, FL) </li><li> Вращающийся гибридизация инкубатора (модель 5420, VWR) </li><li> Размахивая-ведро центрифугу (модели 5810R, Эппендорф, Гамбург, Германия) </li><li> Плиты, Costar 96-а (Abgene, Fisher Scientific, Epson, Великобритания) </li><li> Тарелки, 384-а (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ol> Реагенты, применяемые: <ol><li> Pichia pastoris и векторы: напряжение X33, и pPICZ и pPICZα (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) </li><li> Т. reesei и векторы: напряжение QM9414 (Министерство сельского хозяйства США Национальный центр сельскохозяйственных исследований использования, Пеория, штат Иллинойс), а pCB1004-EV (Банерджи и др., 2010b). </li><li> Accellerase 1000 (номер партии 1600844643) (Genencor, Inc, Рочестер, штат Нью-Йорк) </li><li> 50 мМ цитрат натрия буфере, рН 4,8 </li><li> Тетрациклин складе: 10 мг / мл </li><li> Циклогексимид складе: 10 мг / мл </li><li> GOPOD анализа комплекта, каталог K-Gluc (Megazyme, Брей, Ирландия) </li><li> Ксилозы анализа комплекта, каталог K-ксилозы (Megazyme, Брей, Ирландия) </li></ol>

genplat: an automated platform for biomass enzyme discovery and cocktail optimization

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.
GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of &tilde;10 pure enzymes requires less than 100 &mu;g of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).
Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are "mixture" experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.
All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For "core" enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as "accessory" are set to 0%. "Core" and "accessory" are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (&beta;-glucosidase), EX3 (endo-&beta;1,4-xylanase, GH10), and BX (&beta;-xylosidase).
<div id="myEventWatcherDiv">
	 </div>

Watch this Scientific Journal Video about GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization at JoVE.com

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT (GLBRC Фермент Platform) представляет собой автоматизированную платформу для обнаружения и оптимизации фермента коктейли для деградации биомассы. Он может быть адаптирован к нескольким сырья и смеси ферментов, содержащих несколько компонентов.

GENPLAT: Автоматизированная платформа для биомассы Открытие ферментов и коктейль-оптимизации

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Гидрофобные Солт-модифицированный Nafion для иммобилизации ферментов и стабилизации

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Универсальная автоматизированная платформа для микро-масштабе Эксперименты стимуляции клеток

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Развитие<em&gt; In Vitro</em&gt; Глазной Платформа для тестирования Контактные линзы

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Разработка и внедрение автоматизированной освещая, культивированием и система отбора проб для микробного оптогенетика приложений

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

Тестирование производительности платформы для проведения микронасосом с пластиной электрода медью FR-4

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Microfluidic платформа сверхвысокой пропускной способности для одной ячейки генома

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Роман хирургической техники как основы для в естественных условиях частичной печени инженерии в крыса

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...