Name: colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00
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Nous remercions le personnel des laboratoires de pathologie anatomique du Royal Prince Alfred et les hôpitaux rapatriement Concord pour la collecte des échantillons frais du CRC et de la muqueuse intestinale normale. Le travail a été financé par une subvention Cancer Institute Nouvelle-Galles du Sud Programme translationnelle.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Le flux de travail figure 1. Pour la préparation d&#39;une suspension de cellules vivantes à partir d&#39;un échantillon de chirurgie de la CRC. 1. Désagrégation de l&#39;échantillon clinique Tous les échantillons ont été prélevés dans l&#39;hôpital Royal Prince Alfred (Camperdown, NSW, Australie) et l&#39;Hôpital de rapatriement Concord (Concord West, NSW, Australie...

<ol>
	<li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer.">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).</li><li>Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+Consensus+Development+Conference+Statement:+adjuvant+therapy+for+breast+cancer.">National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer.</a> J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).</li><li>Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+classification+of+tumour+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues.">WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues.</a> IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).</li><li>Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+proteomics+and+cancer+biomarker+discovery.">Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery.</a> Clin. Med. Oncol. , (2008).</li><li>Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+leukaemias+and+lymphomas+using+extensive+immunophenotypes+from+an+antibody+microarray.">Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray.</a> Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).</li><li>Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+repertories+of+surface+antigens+on+leukemias+using+an+antibody+microarray.">Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray.</a> Proteomics. 3, 2147 (2003).</li><li>Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+antigen+profiling+of+colorectal+cancer+using+antibody+microarrays+with+fluorescence+multiplexing.">Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).</li><li>Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+surface+molecules+on+colorectal+cancers.">Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers.</a> Proteomics. 6, 1791 (2006).</li><li>Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+mucin.">Rheology of mucin.</a> Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).</li><li>Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+for+cDNA+microarray+data:+a+robust+composite+method+addressing+single+and+multiple+slide+systematic+variation.">Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.</a> Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).</li><li>Al Saeed, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMA:+A+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> BioTechniques. 34, 374-378 (2003).</li></ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons comment les biopuces d&#39;anticorps DotScan peut être utilisé dans un simple, semi-quantitative façon d&#39;étudier les profils d&#39;antigène de surface pour les populations de cellules du tissu CRC. L&#39;obtention d&#39;une suspension de cellules viables unique à partir de tissus est essentielle à la réussite de l&#39;expérience, parce que dépendant de l&#39;énergie des processus (par exemple, l&#39;antigène le recouvrement et / ou la forma...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
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Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif ou de l&#39;équipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Hanks solution salée équilibrée </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6136-10X1L </td><td> Tamponné avec 25 mM HEPES (Sigma # H3375) </td></tr><tr><td> Airpure sécurité biologique de classe II du cabinet </td><td> Westinghouse </td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td> Lames chirurgicales </td><td> Livingstone </td><td> 090609 </td><td> Paquet de 100 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 avec 2 mM Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4130-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase de type 4 </td><td> Worthington </td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td> Désoxyribonucléase 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25-1G </td><td></td></tr><tr><td> Terumo Seringue (10 ml) </td><td> Terumo </td><td> SS 10 L </td><td> Boîte de 100 </td></tr><tr><td> Filcon filtre (200 m) </td><td> BD Biosciences </td><td> 340615 </td><td></td></tr><tr><td> Filcon filtre (50 microns) </td><td> Filcon filtre (50 microns) </td><td> Filcon filtre (50 microns) Filcon filtre (50 microns) 340 603 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse 5810 R </td><td> Eppendorf </td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Le bleu trypan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td> Hirschmann </td><td> pas disponible </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à lumière </td><td> Nikon </td><td> Nikon TMS </td><td></td></tr><tr><td> Tubes Cyrovial </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 121278 </td><td></td></tr><tr><td> Contrainer congélation Cryo </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan anticorps microarray kit </td><td> Medsaic </td><td> pas disponible </td><td></td></tr><tr><td> Bac DotScan laver les biopuces </td><td> Medsaic </td><td> pas disponible </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldéhyde 37% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td> pas disponible </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine sérique bovine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9418-10G </td><td></td></tr><tr><td> Inactivés par la chaleur du sérum AB 2% </td><td> Invitrogen </td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td> Phycoérythrine conjuguée CD3 </td><td> Beckman Coulter </td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647 conjugué EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324212 </td><td></td></tr><tr><td> Typhon FLA 9000 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9558-08 </td><td> 532 nm laser, 580, BP30 émission pour les PE filtre. 633 nm laser et 670 BP30 émissions pour Alexa647 filtre </td></tr><tr><td> MultiExperiment Viewer v4.4 </td><td> TM4 Microarray Suite logicielle </td><td> Open - source (Réf 11) </td><td></td></tr></tbody></table>

colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing

Le pronostic actuel et la classification des CRC repose sur la stadification des systèmes qui intègrent les résultats histopathologiques et cliniques. Cependant, dans la majorité des cas de CCR, le dysfonctionnement cellulaire est le résultat de nombreuses mutations qui modifient l&#39;expression des protéines et des modifications post-traductionnelles 1. Un certain nombre d&#39;antigènes de surface cellulaire, y compris les clusters de différenciation (CD) antigènes, ont été identifiés comme pronostiques potentiels ou métastatique chez les biomarqueurs CRC. Ces antigènes font biomarqueurs idéal comme leur expression change souvent avec la progression tumorale ou des interactions avec d&#39;autres types cellulaires, comme les lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) et les macrophages associés aux tumeurs (TAM). L&#39;utilisation de l&#39;immunohistochimie (IHC) pour le cancer de la sous-classification et le pronostic est bien établi pour certains types de tumeurs 2,3. Cependant, pas un seul «marqueur» a montré l&#39;importance pronostique supérieure clinico-pathologiques ou de mise en scène gagné l&#39;acceptation large pour une utilisation dans les rapports de pathologie de routine de tous les cas, le CRC. Une approche plus récente à la stratification pronostique des phénotypes de la maladie repose sur les profils protéiques de surface en utilisant de multiples «marqueurs». Alors que le profil d&#39;expression des tumeurs en utilisant des techniques telles que la protéomique iTRAQ est un outil puissant pour la découverte de biomarkers4, il n&#39;est pas optimale pour une utilisation de routine dans les laboratoires de diagnostic et ne peuvent pas distinguer différents types de cellules dans une population mixte. En outre, de grandes quantités de tissus tumoraux sont nécessaires pour le profilage des glycoprotéines purifiées membrane plasmique par ces méthodes. Dans cette vidéo, nous avons décrit une méthode simple pour le profilage de la surface du protéome de cellules viables à partir d&#39;échantillons CRC ventilées en utilisant une puce à anticorps DotScan CRC. La puce 122-anticorps se compose d&#39;une norme 82-anticorps reconnaissant la région une gamme de la lignée des marqueurs spécifiques des leucocytes, des molécules d&#39;adhésion, les récepteurs et les marqueurs de l&#39;inflammation et la réponse immunitaire 5, avec une région par satellite pour la détection de 40 marqueurs potentiellement pronostique pour le CRC . Les cellules sont capturées uniquement sur les anticorps pour lequel ils expriment l&#39;antigène correspondant. La densité cellulaire par point, déterminé par balayage optique, reflète la proportion de cellules exprimant l&#39;antigène, le niveau d&#39;expression de l&#39;antigène et l&#39;affinité de l&#39;anticorps 6. Pour les tissus normaux CRC ou la muqueuse intestinale, balayages optiques reflètent l&#39;immunophénotype des populations mixtes de cellules. Multiplexage par fluorescence peut alors être utilisé pour le profil sélectionné sous-populations de cellules d&#39;intérêt capturés sur le tableau. Par exemple, Alexa 647 molécules anti-adhérence des cellules épithéliales (EpCAM; CD326), est un antigène de différenciation pan-épithéliales qui a été utilisé pour détecter les cellules CRC et aussi les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale normale, tandis que la phycoérythrine-anticorps anti-CD3, a été utilisé pour détecter l&#39;infiltration de cellules T 7. Le CRC DotScan biopuces devrait être le prototype d&#39;une alternative de diagnostic pour le système anatomique basée sur scène CRC.

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Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Nous avons décrit une procédure pour la désagrégation du cancer colorectal (CCR) pour produire des cellules viables unique, qui sont ensuite saisies sur biopuces d&#39;anticorps reconnaissant les antigènes de surface sur mesure (CRC DotScan micropuce). Les sous-populations de cellules lié à la puce peut être profilée par multiplexage de fluorescence à l&#39;aide d&#39;anticorps monoclonaux marqués avec des colorants fluorescents.

Colorectal Cancer Cell Surface Protein profilage utilisant une biopuces d&#39;anticorps et de multiplexage par fluorescence

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

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