Name: colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing at JoVE.com

Wir danken Mitarbeiter am Anatomischen Pathologie Laboratories des Royal Prince Alfred und Concord Rückführung Krankenhäuser zum Sammeln frischer Proben von CRC und normalen Darmschleimhaut. Die Arbeit wurde durch einen Cancer Institute New South Wales Translational-Zuschüssen finanziert.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Arbeitsablauf für die Herstellung einer Suspension von lebenden Zellen aus einem chirurgischen Stichprobe von CRC. 1. Klinische Probe Disaggregation Alle Proben wurden von der Royal Prince Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australien) und Concord Rückführung Hospital (Concord West, NSW, Australien) mit Einwilligung im Rahmen des Protokolls Nr. X08-164 gesammelt...

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	<li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer.">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).</li><li>Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+Consensus+Development+Conference+Statement:+adjuvant+therapy+for+breast+cancer.">National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer.</a> J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).</li><li>Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+classification+of+tumour+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues.">WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues.</a> IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).</li><li>Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+proteomics+and+cancer+biomarker+discovery.">Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery.</a> Clin. Med. Oncol. , (2008).</li><li>Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+leukaemias+and+lymphomas+using+extensive+immunophenotypes+from+an+antibody+microarray.">Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray.</a> Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).</li><li>Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+repertories+of+surface+antigens+on+leukemias+using+an+antibody+microarray.">Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray.</a> Proteomics. 3, 2147 (2003).</li><li>Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+antigen+profiling+of+colorectal+cancer+using+antibody+microarrays+with+fluorescence+multiplexing.">Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).</li><li>Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+surface+molecules+on+colorectal+cancers.">Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers.</a> Proteomics. 6, 1791 (2006).</li><li>Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+mucin.">Rheology of mucin.</a> Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).</li><li>Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+for+cDNA+microarray+data:+a+robust+composite+method+addressing+single+and+multiple+slide+systematic+variation.">Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.</a> Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).</li><li>Al Saeed, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMA:+A+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> BioTechniques. 34, 374-378 (2003).</li></ol>

In diesem Video zeigen wir, wie das DotScan Antikörper Microarray in einer einfachen, semi-quantitative Weg, um Oberflächen-Antigen-Profile für Zellpopulationen aus CRC Gewebe Studie verwendet werden kann. Die Erteilung einer tragfähigen Einzel Zellsuspension aus Gewebe ist entscheidend für den Erfolg des Experiments, weil die Energie-abhängige Prozesse (zB, Antigen Begrenzung und / oder Pseudopodien-Bildung), für feste Bindung von ganzen Zellen zu Antikörper Punkte während der Inku...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
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Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagens oder Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Hanks &#39;balanced salt solution </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6136-10X1L </td><td> Buffered mit 25 mM Hepes (Sigma # H3375) </td></tr><tr><td> Airpure biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II </td><td> Westinghouse </td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Klingen </td><td> Livingstone </td><td> 090609 </td><td> Packung mit 100 Stück </td></tr><tr><td> RPMI 1640 mit 2 mM Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4130-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ 4 </td><td> Worthington </td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25-1G </td><td></td></tr><tr><td> Terumo Spritze (10 ml) </td><td> Terumo </td><td> MS +10 L </td><td> Box von 100 </td></tr><tr><td> Filcon Filter (200 um) </td><td> BD Biosciences </td><td> 340615 </td><td></td></tr><tr><td> Filcon Filter (50 um) </td><td> Filcon Filter (50 um) </td><td> Filcon Filter (50 um) Filcon Filter (50 um) 340603 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge 5810 R </td><td> Eppendorf </td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td> Hirschmann </td><td> nicht verfügbar </td><td></td></tr><tr><td> Lichtmikroskop </td><td> Nikon </td><td> Nikon TMS </td><td></td></tr><tr><td> Cyrovial Rohre </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 121278 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo Einfrieren contrainer </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan Antikörper Microarray-Kit </td><td> Medsaic </td><td> nicht verfügbar </td><td></td></tr><tr><td> DotScan Microarray Waschküvette </td><td> Medsaic </td><td> nicht verfügbar </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd 37% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td> nicht verfügbar </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9418-10G </td><td></td></tr><tr><td> Heat-inaktivierten AB-Serum 2% </td><td> Invitrogen </td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td> Phycoerythrin-konjugierten CD3 </td><td> Beckman Coulter </td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647-konjugierten EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324212 </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon FLA 9000 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9558-08 </td><td> 532 nm-Laser, 580 BP30 Emissionsfilter für PE. 633 nm-Laser und 670 BP30 Emissionsfilter für Alexa647 </td></tr><tr><td> MultiExperiment-Viewer v4.4 </td><td> TM4 Microarray Software Suite </td><td> Open - Source-Software (Ref 11) </td><td></td></tr></tbody></table>

colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing

Die aktuelle Prognose und Klassifikation von CRC basiert auf Staging-Systeme, die histopathologischen und klinischen Befunden zu integrieren. Doch in der Mehrzahl der CRC Fällen ist Zelldysfunktion das Ergebnis zahlreicher Mutationen, die Protein-Expression und posttranslationale Modifikation 1 ändern. Eine Reihe von Zell-Oberflächen-Antigene, einschließlich Cluster der Differenzierung (CD)-Antigene wurden als potenzielle prognostische oder metastasiertem Biomarker in CRC identifiziert worden. Diese Antigene bilden ideale Biomarker als ihren Ausdruck oft ändert sich mit Tumorprogression oder Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen, wie zB Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) und Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM). Die Verwendung von Immunhistochemie (IHC) für Krebs sub-Klassifikation und Prognose ist gut für einige Tumorarten 2,3 etabliert. Es wurde jedoch keine einzige &quot;Marker&quot; prognostische Signifikanz gezeigt größer als klinisch-pathologischen Staging-oder gewonnen breite Akzeptanz für den Einsatz in der Routine-Pathologie Meldung aller CRC Fällen. Ein neuerer Ansatz, um prognostische Stratifizierung Krankheitsphänotypen setzt auf Oberflächenprotein Profile mit mehreren &quot;Marker&quot;. Während Expression Profiling von Tumoren mit Proteom-Techniken wie iTRAQ ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entdeckung der biomarkers4, ist es nicht optimal für den routinemäßigen Einsatz in diagnostischen Laboratorien und kann nicht unterscheiden, verschiedene Zelltypen in eine gemischte Bevölkerung. Darüber hinaus werden große Mengen von Tumorgewebe für die Profilierung des gereinigten Plasmamembran Glykoproteine ​​durch diese Methoden erforderlich. In diesem Video haben wir beschrieben, eine einfache Methode zur Oberfläche Proteom-Profiling von lebensfähigen Zellen aus aufgeschlüsselte CRC-Proben mit einem DotScan CRC Antikörper Microarray. Die 122-Antikörper Microarray besteht aus einem Standard-82-Antikörper Region die Anerkennung einer Reihe von Lineage-spezifische Leukozyten-Marker, Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren und Marker der Entzündung und Immunantwort 5, zusammen mit einem Satelliten-Region für den Nachweis von 40 potentiell prognostischer Marker für CRC . Die Zellen sind nur auf Antikörper, für die sie ausdrücken, das entsprechende Antigen erfasst. Die Zelldichte pro Punkt, durch optische Abtastung ermittelt, spiegelt der Anteil der Zellen, die das Antigen, das Niveau der Expression des Antigens und der Affinität des Antikörpers 6. Für CRC Gewebe oder normalen Darmschleimhaut, spiegeln optische Scans der Immunphänotyp von gemischten Populationen von Zellen. Fluoreszenz-Multiplexing können dann verwendet werden, um ausgewählte Sub-Populationen von Zellen von Interesse auf dem Array erfasst Profil. Zum Beispiel, Alexa 647-anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM, CD326) ist ein pan-epitheliales Differenzierungsantigen, die zur CRC-Zellen und auch Epithelzellen der normalen Darmschleimhaut erkennen war, während Phycoerythrin-anti-CD3, wurde verwendet, zu erkennen infiltrierenden T-Zellen 7. Das DotScan CRC Microarray sollte der Prototyp für eine diagnostische Alternative zu den anatomisch-basierte CRC Staging-System sein.

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Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Wir beschrieben ein Verfahren für die Zerlegung von Darmkrebs (CRC), lebensfähige einzelne Zellen, die dann auf kundenspezifische Antikörper Microarrays erkennen Oberflächen-Antigene (DotScan CRC-Microarray) erfasst zu produzieren. Sub-Populationen von Zellen gebunden, die Microarray kann durch Fluoreszenz-Multiplexing mit monoklonalen Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert profiliert werden.

Darmkrebs Zelloberflächenprotein Profiling mit einem Antikörper Microarray und Fluoreszenz Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Immuno-Fluoreszenz-Assay von Leptospira-Surface-exponierten Proteine

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Einzellige Quantifizierung der mRNA und Oberfläche Protein-Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...