Name: colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00
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Ringraziamo il personale presso i Laboratori Anatomia Patologica del Principe Reale Alfred e Ospedali rimpatrio Concord per la raccolta di campioni freschi di CRC e normale mucosa intestinale. Il lavoro è stato finanziato da un Istituto di Grant Cancro New South Wales Programma traslazionale.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Flusso di lavoro per la preparazione di una sospensione di cellule vive da un campione chirurgico di CRC. 1. Disaggregazione del campione clinico Tutti i campioni sono stati raccolti dal Principe Reale Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australia) e l&#39;Ospedale rimpatrio Concord (Concord West, NSW, Australia) con il consenso informato ai sensi del protocollo n. X08-16...

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	<li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer.">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).</li><li>Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+Consensus+Development+Conference+Statement:+adjuvant+therapy+for+breast+cancer.">National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer.</a> J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).</li><li>Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+classification+of+tumour+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues.">WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues.</a> IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).</li><li>Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+proteomics+and+cancer+biomarker+discovery.">Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery.</a> Clin. Med. Oncol. , (2008).</li><li>Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+leukaemias+and+lymphomas+using+extensive+immunophenotypes+from+an+antibody+microarray.">Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray.</a> Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).</li><li>Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+repertories+of+surface+antigens+on+leukemias+using+an+antibody+microarray.">Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray.</a> Proteomics. 3, 2147 (2003).</li><li>Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+antigen+profiling+of+colorectal+cancer+using+antibody+microarrays+with+fluorescence+multiplexing.">Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).</li><li>Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+surface+molecules+on+colorectal+cancers.">Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers.</a> Proteomics. 6, 1791 (2006).</li><li>Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+mucin.">Rheology of mucin.</a> Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).</li><li>Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+for+cDNA+microarray+data:+a+robust+composite+method+addressing+single+and+multiple+slide+systematic+variation.">Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.</a> Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).</li><li>Al Saeed, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMA:+A+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> BioTechniques. 34, 374-378 (2003).</li></ol>

In questo video ci dimostra come il microarray anticorpi DotScan può essere utilizzato in modo semplice, semi-quantitativa modo per studiare i profili antigene di superficie per le popolazioni di cellule dal tessuto CRC. Ottenere una sospensione vitale singola cellula da tessuto è fondamentale per il successo dell&#39;esperimento, perché l&#39;energia-dipendente dei processi (ad esempio, l&#39;antigene tappatura e / o formazione di pseudopodi) sembrano essere necessari per il legame ditta...

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Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente o attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Sale Hanks &#39;soluzione equilibrata </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6136-10X1L </td><td> Tamponata con 25 mM Hepes (Sigma # H3375) </td></tr><tr><td> Airpure gabinetto di sicurezza biologica di classe II </td><td> Westinghouse </td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td> Lame chirurgiche </td><td> Livingstone </td><td> 090609 </td><td> Confezione da 100 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 con 2 mM Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4130-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi tipo 4 </td><td> Worthington </td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td> Deossiribonucleasi 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25-1G </td><td></td></tr><tr><td> Siringa Terumo (10 ml) </td><td> Terumo </td><td> SS 10 L </td><td> Scatola da 100 </td></tr><tr><td> Filcon Filtro (200 micron) </td><td> BD Biosciences </td><td> 340615 </td><td></td></tr><tr><td> Filcon filtro (50 micron) </td><td> Filcon filtro (50 micron) </td><td> Filcon filtro (50 micron) Filcon filtro (50 micron) 340603 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di vitello fetale </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga 5810 R </td><td> Eppendorf </td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Blu tripano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td> Hirschmann </td><td> non disponibile </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio ottico </td><td> Nikon </td><td> Nikon TMS </td><td></td></tr><tr><td> Tubi Cyrovial </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 121278 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo congelamento contrainer </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan anticorpi microarray kit </td><td> Medsaic </td><td> non disponibile </td><td></td></tr><tr><td> DotScan microarray lavare vassoio </td><td> Medsaic </td><td> non disponibile </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeide 37% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td> non disponibile </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9418-10G </td><td></td></tr><tr><td> Inattivati ​​al calore siero AB 2% </td><td> Invitrogen </td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoeritrina coniugati CD3 </td><td> Beckman Coulter </td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647 coniugato EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324212 </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon FLA 9000 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9558-08 </td><td> Laser 532 nm, 580 BP30 emissione filtro per PE. 633 e 670 nm laser BP30 emissione filtro per Alexa647 </td></tr><tr><td> MultiExperiment Viewer v4.4 </td><td> TM4 Microarray Software Suite </td><td> Software open - source (Rif. 11) </td><td></td></tr></tbody></table>

colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing

La prognosi attuale e classificazione dei CRC si basa sulla messa in scena di sistemi che integrano i risultati istopatologici e clinici. Tuttavia, nella maggior parte dei casi CRC, la disfunzione delle cellule è il risultato di numerose mutazioni che modificano l&#39;espressione di proteine ​​e modificazioni post-traduzionali 1. Un certo numero di antigeni di superficie cellulare, tra cui cluster di differenziazione (CD) antigeni, sono stati identificati come potenziali o biomarker prognostico nel CRC metastatico. Questi antigeni rendono ideale come biomarcatori spesso la loro espressione cambia con la progressione del tumore o interazioni con altri tipi di cellule, come i linfociti infiltranti il ​​tumore (TILS) e macrofagi associati al tumore (TAM). L&#39;uso di immunoistochimica (IHC) per il tumore sub-classificazione e la prognosi è ben consolidata per alcuni tipi di tumore 2,3. Tuttavia, nessun singolo &#39;marker&#39; ha mostrato un significato prognostico maggiore clinico-patologici di sosta o guadagnato un largo consenso per l&#39;uso in routine patologia segnalazione di tutti i casi CRC. Un approccio più recente stratificazione prognostica dei fenotipi malattia si basa su profili di proteina di superficie utilizzando più &#39;marker&#39;. Mentre profili di espressione dei tumori con tecniche di proteomica, come iTRAQ è un potente strumento per la scoperta di biomarkers4, non è ottimale per l&#39;uso di routine nei laboratori diagnostici e non può distinguere i diversi tipi di cellule in una popolazione mista. Inoltre, grandi quantità di tessuto tumorale sono necessari per il profiling delle glicoproteine ​​membrana plasmatica purificati da questi metodi. In questo video abbiamo descritto un metodo semplice per la profilatura proteoma superficie delle cellule vitali da disaggregati campioni CRC utilizzando un anticorpo DotScan CRC microarray. Il 122-anticorpo microarray è costituito da un normale 82-anticorpi regione riconoscere una serie di marcatori lignaggio leucociti-specifici, molecole di adesione, recettori e marcatori di infiammazione e la risposta immunitaria 5, insieme ad una regione satellitare per l&#39;individuazione di 40 potenziali marcatori prognostici per la CRC . Le cellule vengono catturati solo gli anticorpi per i quali essi esprimono l&#39;antigene corrispondente. La densità delle cellule per punto, determinato attraverso la scansione ottica, riflette la proporzione di cellule che esprimono l&#39;antigene, il livello di espressione dell&#39;antigene e l&#39;affinità degli anticorpi 6. Per il tessuto CRC o normale mucosa intestinale, scansioni ottiche riflettono l&#39;immunofenotipo delle popolazioni miste di cellule. Multiplexing fluorescenza può quindi essere utilizzato per il profilo selezionato sotto-popolazioni di cellule di interesse catturato l&#39;array. Per esempio, Alexa 647-anti-molecola di adesione delle cellule epiteliali (carcinomi, CD326), è un pan-antigene epiteliale di differenziazione che è stato utilizzato per rilevare le cellule CRC e anche le cellule epiteliali della mucosa intestinale normale, mentre ficoeritrina-anti-CD3, è stato utilizzato per rilevare infiltrazione delle cellule T 7. Il DotScan CRC microarray dovrebbe essere il prototipo di una diagnosi alternativa al anatomicamente basato su sistema di stadiazione CRC.

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Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Abbiamo descritto una procedura per la disaggregazione del tumore del colon-retto (CRC) per la produzione di singole cellule vitali, che vengono poi catturate su microarray anticorpi personalizzato riconoscere gli antigeni di superficie (DotScan CRC microarray). Sotto-popolazioni di cellule legato al microarray può essere profilato con multiplazione a fluorescenza utilizzando anticorpi monoclonali taggati con coloranti fluorescenti.

Carcinoma del colon-retto Profilo delle proteine ​​di superficie L&#39;utilizzo di un anticorpo Microarray e Multiplexing fluorescenza

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