Name: colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00
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Agradecemos a equipe do Laboratório de Anatomia Patológica do Príncipe Real Alfred e Hospitais Repatriação Concord para a recolha de amostras frescas de CRC e na mucosa intestinal normal. O trabalho foi financiado por um New South Wales Instituto do Câncer Grant Programa translacional.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="Figura 1" /> O fluxo de trabalho figura 1. Para a preparação de uma suspensão de células vivas a partir de uma amostra cirúrgica do CRC. 1. Desagregação amostra clínica Todas as amostras foram coletadas do Príncipe Real Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Austrália) e Hospital Repatriação Concord (Concord West, NSW, Austrália) com o consentimento informado nos termos do Protocolo n...

<ol>
	<li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer.">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).</li><li>Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+Consensus+Development+Conference+Statement:+adjuvant+therapy+for+breast+cancer.">National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer.</a> J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).</li><li>Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+classification+of+tumour+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues.">WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues.</a> IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).</li><li>Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+proteomics+and+cancer+biomarker+discovery.">Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery.</a> Clin. Med. Oncol. , (2008).</li><li>Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+leukaemias+and+lymphomas+using+extensive+immunophenotypes+from+an+antibody+microarray.">Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray.</a> Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).</li><li>Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+repertories+of+surface+antigens+on+leukemias+using+an+antibody+microarray.">Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray.</a> Proteomics. 3, 2147 (2003).</li><li>Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+antigen+profiling+of+colorectal+cancer+using+antibody+microarrays+with+fluorescence+multiplexing.">Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).</li><li>Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+surface+molecules+on+colorectal+cancers.">Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers.</a> Proteomics. 6, 1791 (2006).</li><li>Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+mucin.">Rheology of mucin.</a> Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).</li><li>Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+for+cDNA+microarray+data:+a+robust+composite+method+addressing+single+and+multiple+slide+systematic+variation.">Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.</a> Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).</li><li>Al Saeed, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMA:+A+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> BioTechniques. 34, 374-378 (2003).</li></ol>

Neste vídeo, demonstramos como o microarray de anticorpos DotScan pode ser usado em uma forma simples e semi-quantitativa para estudar perfis de antígeno de superfície para as populações de células do tecido CRC. Obtenção de uma suspensão de células viáveis ​​único a partir do tecido é fundamental para o sucesso do experimento, porque a energia dependente de processos (por exemplo, antígeno de nivelamento e / ou formação de pseudópodos) parecem ser necessárias para a li...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
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Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente ou equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Solução de Hanks salina balanceada </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6136-10X1L </td><td> Tamponado com Hepes 25 mM (Sigma # H3375) </td></tr><tr><td> Airpure gabinete de segurança biológica classe II </td><td> Westinghouse </td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas cirúrgicas </td><td> Livingstone </td><td> 090609 </td><td> Pacote de 100 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 com 2 mM Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4130-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase tipo 4 </td><td> Worthington </td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td> Desoxirribonuclease 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25-1G </td><td></td></tr><tr><td> Terumo Seringa (10 mL) </td><td> Terumo </td><td> SS L 10 </td><td> Caixa de 100 </td></tr><tr><td> Filcon filtro (200 mm) </td><td> BD Biosciences </td><td> 340615 </td><td></td></tr><tr><td> Filcon filtro (50 mm) </td><td> Filcon filtro (50 mm) </td><td> Filcon filtro (50 mm) Filcon filtro (50 mm) 340603 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga 5810 R </td><td> Eppendorf </td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de tripano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td> Hirschmann </td><td> não disponível </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de luz </td><td> Nikon </td><td> Nikon TMS </td><td></td></tr><tr><td> Tubos Cyrovial </td><td> Greiner bio-one </td><td> 121278 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo contrainer congelamento </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan anticorpos microarray kit </td><td> Medsaic </td><td> não disponível </td><td></td></tr><tr><td> DotScan bandeja de lavar microarray </td><td> Medsaic </td><td> não disponível </td><td></td></tr><tr><td> KimWipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> Formol 37% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td> não disponível </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9418-10G </td><td></td></tr><tr><td> Inativado pelo calor soro AB 2% </td><td> Invitrogen </td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoeritrina conjugada CD3 </td><td> Beckman Coulter </td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647 conjugada EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324212 </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon FLA 9000 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9558-08 </td><td> 532 nm do laser, 580 BP30 emissão filtro para PE. 633 nm do laser e 670 BP30 emissão filtro para Alexa647 </td></tr><tr><td> MultiExperiment Visualizador v4.4 </td><td> TM4 Microarray Software Suite </td><td> Open - software de código (Ref 11) </td><td></td></tr></tbody></table>

colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing

O prognóstico atual e classificação do CRC conta com encenação de sistemas que integram achados histopatológicos e clínicos. No entanto, na maioria dos casos CRC, disfunção das células é o resultado de numerosas mutações que modificam a expressão da proteína e pós-translacionais modificação 1. Um número de antígenos de superfície celular, incluindo cluster de diferenciação (CD) de antígenos, foram identificados como prognósticos ou potenciais biomarcadores metastático em CRC. Estes antígenos fazer biomarcadores ideal como sua expressão muitas vezes muda com a progressão do tumor ou interações com outros tipos de células, como linfócitos tumor infiltrantes (TILs) e tumor associado macrófagos (TAMs). O uso da imuno-histoquímica (IHQ) para o câncer de sub-classificação e prognóstico é bem estabelecida para alguns tipos de tumor 2,3. No entanto, não &#39;marcador&#39; single mostrou significado prognóstico maior do que clínico-patológica de teste ou ganhou ampla aceitação para uso em relatórios de patologia de rotina de todos os casos CRC. Uma abordagem mais recente para a estratificação prognóstica de fenótipos da doença depende de perfis de proteínas de superfície usando vários &quot;marcadores&quot;. Enquanto perfil de expressão de tumores através de técnicas proteômicas como iTRAQ é uma poderosa ferramenta para a descoberta de biomarkers4, não é ideal para uso rotineiro nos laboratórios de diagnóstico e não pode distinguir diferentes tipos de células em uma população mista. Além disso, grandes quantidades de tecido tumoral são necessários para a caracterização de glicoproteínas da membrana plasmática purificada por estes métodos. Neste vídeo nós descrevemos um método simples para criar perfis de superfície proteoma de células viáveis ​​a partir de amostras desagregadas CRC usando um anticorpo DotScan microarray CRC. O microarray 122-anticorpo consiste em uma região de anticorpos 82-standard reconhecendo uma série de marcadores de linhagem específica de leucócitos, moléculas de adesão, receptores e marcadores de inflamação e resposta imune 5, bem como uma região satélite para a detecção de 40 marcadores potencialmente prognóstico para CRC . Células são capturadas apenas em anticorpos para os quais eles expressam o antígeno correspondente. A densidade de células por ponto, determinado pelo escaneamento óptico, reflete a proporção de células que expressam esse antígeno, o nível de expressão do antígeno e afinidade do anticorpo 6. CRC de tecido ou mucosa intestinal normal, scans óptica refletem o imunofenótipo de populações mistas de células. Multiplexação de fluorescência pode então ser usada para perfil selecionado sub-populações de células de interesse capturado no array. Por exemplo, Alexa molécula de adesão 647-anti-células epiteliais (EpCAM; CD326), é um antígeno de diferenciação pan-epiteliais que foi usado para detectar células CRC e também células epiteliais da mucosa intestinal normal, enquanto Ficoeritrina-anti-CD3, foi usado para detectar infiltração de células T-7. O CRC DotScan microarray deve ser o protótipo de uma alternativa de diagnóstico para o sistema de estadiamento baseado anatomicamente CRC.

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Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Nós descrevemos um procedimento para a desagregação de câncer colorretal (CRC) para produzir células viáveis ​​única, que são, então, capturado em microarrays de anticorpos personalizado reconhecer antígenos de superfície (CRC DotScan microarray). Sub-populações de células vinculada ao microarray pode ser perfilado por multiplexação de fluorescência usando anticorpos monoclonais marcados com corantes fluorescentes.

Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Imunologia e Infecção

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Imuno-fluorescência Ensaio de Leptospirose superfície exposta Proteínas

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

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Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Rotulagem de anticorpos com corantes fluorescentes utilizando proteína Magnetic A e esferas de proteína G

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

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Um ensaio de Microarray da proteína para determinação sorológica do antígeno-específicas anticorpo respostas seguintes Clostridium difficile infecção

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

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Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

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Usando avançada proteína de fluorescência verde-expressando Escherichia Coli para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de Mouse

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...