Name: colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing at JoVE.com

Damos las gracias al personal del Anatómico laboratorios de patología de la Royal Prince Alfred y Hospitales de Concordia repatriación de recogida de muestras frescas de la CRC y la mucosa intestinal normal. El trabajo fue financiado por una beca del Instituto del Cáncer de Nueva Gales del Sur Programa traslacional.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Flujo de trabajo para la preparación de una suspensión de células vivas de una muestra quirúrgica del CRC. 1. Desagregación de la muestra clínica Todas las muestras fueron recolectadas en el Hospital Royal Prince Alfred (Camperdown, NSW, Australia) y el Hospital Concord de Repatriación (Concord West, NSW, Australia) con el consentimiento informado en el Protocolo...

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	<li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer.">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).</li><li>Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+Consensus+Development+Conference+Statement:+adjuvant+therapy+for+breast+cancer.">National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer.</a> J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).</li><li>Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+classification+of+tumour+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues.">WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues.</a> IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).</li><li>Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+proteomics+and+cancer+biomarker+discovery.">Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery.</a> Clin. Med. Oncol. , (2008).</li><li>Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+leukaemias+and+lymphomas+using+extensive+immunophenotypes+from+an+antibody+microarray.">Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray.</a> Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).</li><li>Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+repertories+of+surface+antigens+on+leukemias+using+an+antibody+microarray.">Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray.</a> Proteomics. 3, 2147 (2003).</li><li>Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+antigen+profiling+of+colorectal+cancer+using+antibody+microarrays+with+fluorescence+multiplexing.">Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).</li><li>Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+surface+molecules+on+colorectal+cancers.">Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers.</a> Proteomics. 6, 1791 (2006).</li><li>Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+mucin.">Rheology of mucin.</a> Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).</li><li>Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+for+cDNA+microarray+data:+a+robust+composite+method+addressing+single+and+multiple+slide+systematic+variation.">Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.</a> Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).</li><li>Al Saeed, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMA:+A+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> BioTechniques. 34, 374-378 (2003).</li></ol>

En este video, que demuestran cómo los microarrays de anticuerpos DotScan se puede utilizar en una forma simple, semi-cuantitativo de manera de estudiar los perfiles de antígeno de superficie de las poblaciones de células del tejido CRC. La obtención de una suspensión de células viables solo a partir de tejido es esencial para el éxito del experimento, ya que depende de la energía los procesos (por ejemplo, el antígeno de recubrimiento y / o la formación de pseudópodos) parecen se...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
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Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo o equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Solución salina balanceada de Hanks </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6136-10X1L </td><td> Tamponado con Hepes 25 mM (Sigma # H3375) </td></tr><tr><td> Airpure gabinete de seguridad biológica de clase II </td><td> Westinghouse </td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td> Hojas de bisturí </td><td> Livingstone </td><td> 090609 </td><td> Paquete de 100 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 con 2 mM Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4130-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa tipo 4 </td><td> Worthington </td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td> Desoxirribonucleasa 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25-1G </td><td></td></tr><tr><td> Terumo jeringa (10 ml) </td><td> Terumo </td><td> SS 10 L </td><td> Caja de 100 </td></tr><tr><td> Filcon filtro (200 m) </td><td> BD Biosciences </td><td> 340615 </td><td></td></tr><tr><td> Filcon filtro (50 micras) </td><td> Filcon filtro (50 micras) </td><td> Filcon filtro (50 micras) Filcon filtro (50 micras) y 340.603 </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga 5810 R </td><td> Eppendorf </td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> El azul tripán </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td> Hirschmann </td><td> no está disponible </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de luz </td><td> Nikon </td><td> Nikon TMS </td><td></td></tr><tr><td> Tubos Cyrovial </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 121278 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo contrainer congelación </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan anticuerpos microarrays kit </td><td> Medsaic </td><td> no está disponible </td><td></td></tr><tr><td> DotScan microarrays bandeja de lavado </td><td> Medsaic </td><td> no está disponible </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehído 37% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td> no está disponible </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9418-10G </td><td></td></tr><tr><td> Inactivado por calor suero AB 2% </td><td> Invitrogen </td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoeritrina conjugado CD3 </td><td> Beckman Coulter </td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647 conjugado EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324212 </td><td></td></tr><tr><td> Tifón FLA 9000 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9558-08 </td><td> 532 nm láser, 580 BP30 emisión de filtro para el PE. 633 nm láser y 670 BP30 emisión de filtro para Alexa647 </td></tr><tr><td> Multiexperiment Visor v4.4 </td><td> TM4 Microarrays Software Suite </td><td> Abierto - el software de código (Ref 11) </td><td></td></tr></tbody></table>

colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing

El pronóstico actual y la clasificación de la Convención se basa en la puesta en escena de sistemas que se integran los hallazgos histopatológicos y clínicos. Sin embargo, en la mayoría de los casos de CCR, disfunción de las células es el resultado de numerosas mutaciones que modifican la expresión de proteínas y modificaciones post-traduccionales 1. Una serie de antígenos de superficie celular, incluyendo cluster de diferenciación (CD) antígenos, han sido identificados como potenciales de pronóstico o marcadores metastásicos en el CCR. Estos antígenos hacer biomarcadores ideal como su expresión cambia a menudo con la progresión del tumor o interacciones con otros tipos de células, como linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) y los macrófagos asociados al tumor (TAM). El uso de la inmunohistoquímica (IHC) para el cáncer de sub-clasificación y el pronóstico está bien establecido para algunos tipos de tumores 2,3. Sin embargo, no solo &quot;marcador&quot; ha demostrado importancia pronóstica superior clínico-patológicas de ensayo o de ganado amplia aceptación para su uso en la presentación de informes de rutina de todos los casos la patología CRC. Un enfoque más reciente de la estratificación pronóstica de los fenotipos de la enfermedad se basa en los perfiles de proteínas de superficie con varios &quot;marcadores&quot;. Mientras que los perfiles de expresión de los tumores mediante técnicas proteómicas como iTRAQ es una poderosa herramienta para el descubrimiento de biomarkers4, no es el óptimo para su uso rutinario en los laboratorios de diagnóstico y no se pueden distinguir diferentes tipos de células en una población mixta. Además, grandes cantidades de tejido tumoral se requieren para la elaboración de perfiles de las glicoproteínas de la membrana plasmática purificada por estos métodos. En este video se describe un método simple para crear perfiles de la superficie del proteoma de células viables de muestras desglosados ​​CRC utilizando un microarray de anticuerpos DotScan CRC. Los microarrays 122-anticuerpo consiste en un estándar de 82-anticuerpo reconoce una amplia región del linaje de los marcadores específicos de leucocitos, las moléculas de adhesión, los receptores y los marcadores de inflamación y respuesta inmune 5, junto con una región por satélite para la detección de 40 marcadores potencialmente pronóstico de CRC . Las células son capturados sólo en los anticuerpos para los que expresan el antígeno correspondiente. La densidad de las células por punto, determinado por lectura óptica, refleja la proporción de células que expresan ese antígeno, el nivel de expresión del antígeno y la afinidad de los anticuerpos 6. Para el tejido de la Convención o en la mucosa intestinal normal, las exploraciones ópticas reflejan el inmunofenotipo de la población mixta de células. Multiplexación de fluorescencia se puede utilizar con el perfil seleccionado sub-poblaciones de células de interés capturado en la matriz. Por ejemplo, Alexa molécula de adhesión celular 647-anti-epiteliales (EpCAM, CD326), es un antígeno de diferenciación pan-epiteliales que se usa para detectar células CRC y también las células epiteliales de la mucosa intestinal normal, mientras que ficoeritrina anti-CD3, se utilizó para detectar la infiltración de células T 7. El CRC DotScan microarrays debe ser el prototipo de una alternativa de diagnóstico para el sistema de clasificación anatómica basada en CRC.

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Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Se describe un procedimiento para la desagregación de cáncer colorrectal (CCR) para producir células viables único, que son capturados en microarrays de anticuerpos a medida el reconocimiento de los antígenos de superficie (CRC DotScan microarrays). Subpoblaciones de células obligado a los microarrays pueden ser perfiladas por multiplexación de fluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales marcados con colorantes fluorescentes.

Celular del cáncer colorrectal superficie de la proteína perfiles con un microarray de anticuerpos y la multiplexación de fluorescencia

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

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El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Investigación

Inmunología e Infección

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Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

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Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibody Labeling con tintes fluorescentes utilizando proteína magnética A y Proteína G cuentas

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

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Un análisis de Microarray de proteínas para la determinación serológica de anticuerpos las respuestas siguientes infección por Clostridium difficile específica de antígeno

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Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

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Sola célula cuantificación del mRNA y la expresión de la proteína de superficie de CD4 infectados por el Virus de la inmunodeficiencia de los simios+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India

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Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

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Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...