Name: colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing at JoVE.com

Vi tackar personalen på Anatomiska patologi Laboratories i Royal Prince Alfred och Concord Sjukhus Repatriering för insamling av färska prover av barnkonventionen och normala tarmslemhinnan. Arbetet har finansierats av en Cancer Institute i New South Wales Translationell Program Grant.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Arbetsgång för beredning av en suspension av levande celler från en kirurgisk urval av CRC. 1. Kliniska prov uppdelning Alla prover samlades in från Royal Prince Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australien) och Concord Hemsändning Sjukhus (Concord West, NSW, Australien) med informerat samtycke enligt protokoll nr X08-164. <ol><li> Samla färska kolorektal cancer...

<ol>
	<li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer.">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).</li><li>Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+Consensus+Development+Conference+Statement:+adjuvant+therapy+for+breast+cancer.">National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer.</a> J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).</li><li>Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+classification+of+tumour+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues.">WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues.</a> IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).</li><li>Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+proteomics+and+cancer+biomarker+discovery.">Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery.</a> Clin. Med. Oncol. , (2008).</li><li>Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+leukaemias+and+lymphomas+using+extensive+immunophenotypes+from+an+antibody+microarray.">Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray.</a> Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).</li><li>Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+repertories+of+surface+antigens+on+leukemias+using+an+antibody+microarray.">Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray.</a> Proteomics. 3, 2147 (2003).</li><li>Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+antigen+profiling+of+colorectal+cancer+using+antibody+microarrays+with+fluorescence+multiplexing.">Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).</li><li>Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+surface+molecules+on+colorectal+cancers.">Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers.</a> Proteomics. 6, 1791 (2006).</li><li>Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+mucin.">Rheology of mucin.</a> Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).</li><li>Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+for+cDNA+microarray+data:+a+robust+composite+method+addressing+single+and+multiple+slide+systematic+variation.">Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.</a> Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).</li><li>Al Saeed, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMA:+A+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> BioTechniques. 34, 374-378 (2003).</li></ol>

I denna video visar vi hur DotScan antikropp microarray kan användas i en enkel, semi-kvantitativa sätt att studera profiler ytantigen för cellpopulationer från CRC vävnad. Skaffa en livskraftig enda cell avstängning från vävnad är avgörande för framgång i försöket, eftersom energi-beroende processer (t ex, antigen ett tak och / eller pseudopodia bildning) verkar krävas för fasta bindning av hela celler till antikropp prickar under inkubationen, samtidigt som döda celler dä...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au

Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn på reagens eller utrustning </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> Hanks &quot;balanserad saltlösning </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6136-10X1L </td><td> Buffras med 25 mm Hepes (Sigma # H3375) </td></tr><tr><td> Airpure biologiska säkerhetsskåp i klass II </td><td> Westinghouse </td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td> Kirurgiska blad </td><td> Livingstone </td><td> 090.609 </td><td> Förpackning med 100 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 med 2 mm Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4130-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenas typ 4 </td><td> Worthington </td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonukleas 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25-1G </td><td></td></tr><tr><td> Terumo spruta (10 ml) </td><td> Terumo </td><td> SS 10 L </td><td> Låda med 100 </td></tr><tr><td> Filcon filter (200 mikrometer) </td><td> BD Biosciences </td><td> 340.615 </td><td></td></tr><tr><td> Filcon filter (50 mikrometer) </td><td> Filcon filter (50 mikrometer) </td><td> Filcon filter (50 mikrometer) Filcon filter (50 mikrometer) 340.603 </td><td></td></tr><tr><td> Fostrets kalvserum </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifug 5810 R </td><td> Eppendorf </td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetylsulfoxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan blå </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td> Hirschmann </td><td> inte tillgänglig </td><td></td></tr><tr><td> Ljusmikroskop </td><td> Nikon </td><td> Nikon TMS </td><td></td></tr><tr><td> Cyrovial rör </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 121.278 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo frysning contrainer </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan antikropp microarray-kit </td><td> Medsaic </td><td> inte tillgänglig </td><td></td></tr><tr><td> DotScan microarray tvätta fack </td><td> Medsaic </td><td> inte tillgänglig </td><td></td></tr><tr><td> KimWipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd 37% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td> inte tillgänglig </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9418-10G </td><td></td></tr><tr><td> Värmeinaktiverade AB serum 2% </td><td> Invitrogen </td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td> Fykoerytrin-konjugerade CD3 </td><td> Beckman Coulter </td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647-konjugerade EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324.212 </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon FLA 9000 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9558-08 </td><td> 532 nm laser, 580 BP30 utsläpp filter för PE. 633 nm laser och 670 BP30 utsläpp filter för Alexa647 </td></tr><tr><td> MultiExperiment Viewer v4.4 </td><td> TM4 Microarray Software Suite </td><td> Open - källkod (Ref 11) </td><td></td></tr></tbody></table>

colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing

Den nuvarande prognosen och klassificeringen av CRC är beroende av iscensättningen system som integrerar histopatologiska och kliniska fynd. Men i de flesta av CRC fall är cellsdysfunktion resultatet av många mutationer som modifierar protein uttryck och post-translationell modifiering 1. Ett antal av antigener på cellytan, däribland kluster av differentiering (CD) antigener, har identifierats som potentiella prognostiska eller metastaserad biomarkörer i barnkonventionen. Dessa antigener gör idealisk biomarkörer som deras uttryck som ofta förändras med tumörprogression eller interaktioner med andra celltyper, såsom tumör-infiltrera lymfocyter (TILs) och tumör-associerade makrofager (TAMs). Användningen av immunohistokemi (IHC) för cancer sub-klassificering och prognostisering är väl etablerad för vissa tumörtyper 2,3. Dock har ingen enda &quot;markör&quot; visas prognostisk betydelse är större än klinisk-patologisk staging eller vunnit stor acceptans för användning i rutinmässig patologi rapportering av alla CRC fall. En nyare metod för prognostiska skiktning av sjukdom fenotyper bygger på profiler ytprotein använder flera &quot;markörer&quot;. Medan expression profiling av tumörer med hjälp av proteomik tekniker såsom iTRAQ är ett kraftfullt verktyg för upptäckten av biomarkers4 är det inte optimalt för rutinmässig användning i diagnostiska laboratorier och kan inte skilja olika celltyper i en blandad befolkning. Dessutom finns stora mängder tumörvävnad krävs för profilering av renat glykoproteiner plasmamembranet av dessa metoder. I denna video har vi beskrivit en enkel metod för utanpåliggande proteom profilering av livskraftiga celler från uppdelad CRC prover med en DotScan CRC antikropp microarray. Den 122-antikropp microarray består av en standard 82-antikropp regionen att erkänna en rad släkt-specifika leukocyter markörer, adhesionsmolekyler, receptorer och markörer för inflammation och immunsvar 5, tillsammans med en satellit region för detektion av 40 potentiellt prognostiska markörer för CRC . Celler fångas endast på antikroppar som de uttrycker motsvarande antigen. Den celltäthet per punkt, bestäms av optisk avläsning, återspeglar andelen celler som uttrycker att antigen, nivån av uttryck av antigen och affinitet av antikroppen 6. För CRC vävnad eller normala tarmslemhinnan, optiska skannar återspeglar immunofenotyp av blandade populationer av celler. Fluorescens multiplexering kan sedan användas för att profilera utvalda sub-populationer av celler av intresse fångas på matrisen. Till exempel Alexa 647-anti-epitelceller celladhesionsmolekyl (EpCAM, CD326) är en pan-epitelial differentiering antigen som användes för att upptäcka barnkonventionen celler och även epitelceller av normal tarmslemhinnan, medan Phycoerythrin-anti-CD3, användes att upptäcka infiltrera T-celler 7. Den DotScan CRC microarray bör vara prototyp för ett diagnostiskt alternativ till de anatomiskt baserade CRC staging system.

Watch this Scientific Journal Video about Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing at JoVE.com

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Vi beskrev ett förfarande för uppdelning av kolorektal cancer (CRC) för att producera livskraftiga enskilda celler, som sedan fångas på skräddarsydda antikroppar microarrays erkänna ytantigener (DotScan CRC microarray). Sub-populationer av celler bundna till microarray kan profileras med fluorescens multiplexering använda monoklonala antikroppar märkta med fluorescerande färger.

Kolorektal cancer cellytan Proteinprofilering Använda en antikropp microarray och fluorescens Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Med hjälp av en Pan-Viral microarray analys (Virochip) till skärm kliniska prover för virala patogener

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Immuno-fluorescens-analys av Leptospiral Surface-exponerade Proteiner

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ metod för att karakterisera Landskap av värdpatogen Protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibody Labeling med fluorescerande färger med hjälp av magnetisk protein A och protein G pärlor

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

En Protein Microarray analys för serologisk bestämning av Antigen-specifika antikroppen Svaren följande Clostridium difficile infektion

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Encelliga kvantitering av mRNA och ytan proteinuttryck i Simian Immunodeficiency Virus-infekterade CD4+ T celler isolerade från Rhesus makaker

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering av Thymus-beroende och oberoende av Thymus immunglobulin isotypen Svaren hos möss använder Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Använda förbättrade grön fluorescens Protein-uttryckande Escherichia Coli att bedöma mus Peritoneal makrofag fagocytos

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...