Name: monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein
Uploaded: 2012-11-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein at JoVE.com

وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل: شبكة البحوث الوطني للشيخوخة (نفن S93) من قبل مؤسسة العلوم النمساوية (FWF)، والمفوضية الأوروبية المتكاملة MiMAGE المشاريع وPROTEOMAGE، هولندا الجينوم مبادرة / المنظمة الهولندية للأبحاث العلمية (NGI / NWO؛ و05040202 050 - 060-810 NCHA)، ويموله الاتحاد الأوروبي من فترة الحياة شبكة التميز (FP6 036894)، وبرنامج البحوث الموجهة نحو الابتكار على علم الجينوم (SenterNovem؛ IGE01014 وIGE5007).

1. بلازميد البناء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب مخصص بنسبة ضئيلة من النيوكليوتيدات الترميز لDGN (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) وdgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) وligate عليه في ناقلات pEGFP-C1 للحصول على الانصهار في GFP مع DGN / dgnFS (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم ت?...

<ol>
	<li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes.">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).</li><li>Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+oxidized+proteins+by+the+20S+proteasome.">Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome.</a> Biochimi. 83, 301-310 (2001).</li><li>Stangl, K., Stangl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+and+endothelial+(dys)function.">The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function.</a> Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).</li><li>Tuoc, T. C., Stoykova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+ubiquitin-proteosome+system+in+neurogenesis.">Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).</li><li>Rock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+block+the+degradation+of+most+cell+proteins+and+the+generation+of+peptides+presented+on+MHC+class+I+molecules.">Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules.</a> Cell. 78, 761-771 (1994).</li><li>Lehman, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+in+neuropathology.">The ubiquitin proteasome system in neuropathology.</a> Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).</li><li>Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Interplay+between+mitochondrial+and+proteasome+activity+in+skin+aging.">Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging.</a> J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).</li><li>Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+cellular+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+molecules:+role+in+cellular+senescence+and+aging.">Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).</li><li>Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+declines+in+proteasome+activity+in+the+heart.">Age-dependent declines in proteasome activity in the heart.</a> Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).</li><li>Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+activity+in+skeletal+muscle:+A+matter+of+assay+design,+muscle+type,+and+age.">Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age.</a> Anal. Biochem. , (2009).</li><li>Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li><li>Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-lived+green+fluorescent+proteins+for+quantifying+ubiquitin/proteasome-dependent+proteolysis+in+living+cells.">Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).</li><li>Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+model+of+the+ubiquitin/proteasome+system.">A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system.</a> Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+desminopathy+mouse+hearts.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts.</a> FASEB J. 20, 362-364 (2006).</li><li>Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+dysfunction+in+a+polyglutamine+disease+model+occurs+in+the+absence+of+ubiquitin-proteasome+system+impairment+and+inversely+correlates+with+the+degree+of+nuclear+inclusion+formation.">Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).</li><li>Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+proteasome+active+site+allostery+as+revealed+by+subunit-specific+inhibitors.">Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors.</a> Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).</li><li>Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+ubiquitin-dependent+proteolysis+with+green+fluorescent+protein+substrates.">Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates.</a> Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).</li><li>Lener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+Nox4+restricts+the+replicative+lifespan+of+human+endothelial+cells.">The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.</a> Biochem. J. 423, 363-374 (2009).</li></ol>

وقد نشرت أول نشر باستخدام بروتين الفلورية الخضراء (GFP) باعتبارها الركيزة مراسل اليوبيكويتين-proteasome النشاط في 2000 12. ومنذ ذلك الحين، أصبح GFP أداة مشتركة لتصور الأنشطة الخلوية، وخاصة عملية اليوبيكويتين-proteasome. لرصد اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الجسم الحي وقد ت?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> pEGFP-C1 المتجهات </td><td> BD العلوم البيولوجية Clontech </td><td> 6084-1 </td></tr><tr><td> pENTR الاتجاه TOPO الاستنساخ كيت </td><td> إينفيتروجن </td><td> K2400-20 </td></tr><tr><td> pLenti6/V5 الاتجاه كيت TOPO الاستنساخ </td><td> إينفيتروجن </td><td> V496-10 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 الكاشف </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> سيجما </td><td> D5546 </td></tr><tr><td> PVDF تصفية (Rotilabo-Spritzenfilter) </td><td> روث </td><td> P667.1 </td></tr><tr><td> البولي ايثيلين جلايكول </td><td> سيجما </td><td> P2139 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> ميرك </td><td> 1.06404.1000 </td></tr><tr><td> التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco ساليشمال شرق 1X (PBS) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> hexadimethrine بروميد </td><td> سيجما </td><td> 10،768-9 </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> إينفيتروجن </td><td> R21001 </td></tr><tr><td> الكريستال البنفسجي </td><td> سيجما </td><td> C3886 </td></tr><tr><td> FACS أنابيب </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين (القلم بكتيريا) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15140130 </td></tr><tr><td> الجلوتامين L-200 ملي مول </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> MEM غير الأحماض الأمينية الأساسية (NEAA) 100X </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11140035 </td></tr><tr><td> MEM الصوديوم 100 ملي مول البيروفات </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11360039 </td></tr><tr><td> D-(+)-الجلوكوز (45٪) </td><td> سيجما </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Geneticin </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11811023 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> ميرك </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيجما </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> التربسين EDTA-(0.05٪) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25300054 </td></tr></tbody></table>

monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein

Proteasome هو عضية الرئيسي داخل الخلايا المشاركة في تدهور بروتين غير طبيعي من والبروتينات وتتجمع تلف أو المؤكسد 1 و 2. تورط استمرار نشاط proteasome في العديد من العمليات الخلوية الأساسية، مثل الاستجابة للضغط النفسي الخلية 3، تنظيم دورة الخلية والتمايز الخلوي 4 أو استجابة جهاز المناعة 5. وقد يرتبط ضعف النظام اليوبيكويتين-proteasome لنمو الاورام وأمراض الاعصاب 4 و 6. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على انخفاض في النشاط proteasome كنمط من أنماط الشيخوخة الخلوية والشيخوخة العضوي 7 و 8 و 9 و 10. هنا، نقدم طريقة لقياس اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية باستخدام البروتين GFP-DGN الانصهار. لتكون قادرة على رصد اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية الأولية، DNA مكملة لترميز يبني البروتين الفلوري الأخضر (GFP)-DGN انصهار بروتين (GFP-يتم إدراج DGN، غير مستقر) ومتغير يحمل طفرة انزياح الإطار (GFP-dgnFS ومستقرة 11) في التعبير lentiviral ناقلات. نحن نفضل هذا الأسلوب أكثر الأساليب التقليدية لأنها ترنسفكأيشن يضمن كفاءة عالية جدا ترنسفكأيشن مستقلة عن نوع من الخلايا أو سن المتبرع. ويمكن استخدام الفرق بين مضان المعروضة بواسطة GFP-dgnFS (مستقر) والبروتين البروتين زعزعة الاستقرار (GFP-DGN) في غياب أو وجود المانع proteasome لتقدير اليوبيكويتين-proteasome النشاط في كل سلالة خلية معينة. يمكن رصد هذه الاختلافات بواسطة المجهر epifluorescence أو يمكن قياس التدفق الخلوي من قبل.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein at JoVE.com

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

يوصف أسلوب لمراقبة اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية. يتم إنشاء A-degron مزعزعة الاستقرار GFP-(GFP-DGN) ومستقرة انصهار بروتين GFP-dgnFS وtransduced في الخلية باستخدام ناقلات lentiviral التعبير. هذا الأسلوب يسمح لإنشاء خط خلية مستقرة GFP-dgn/GFP-dgnFS معربا عن الذي يمكن اليوبيكويتين-proteasome النشاط المقررة بسهولة باستخدام epifluorescence أو التدفق الخلوي.

رصد اليوبيكويتين-proteasome نشاط في الخلايا الحية باستخدام Degron (DGN)-زعزعة استقرار الأخضر نيون البروتين البروتين مراسل (GFP) على أساس

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching فحوصات (FRAP و FLIP) لقياس حيوية الكروماتين البروتين في الخلايا الحية الجذعية الجنينية

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...