Name: monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein
Uploaded: 2012-11-10T14:00:00
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Cette étude a été financée par le Réseau national de recherche sur le vieillissement (PNN S93) par le scientifique autrichien Foundation (FWF), la Commission européenne des projets intégrés et MiMAGE PROTEOMAGE, Pays-Bas Genomics Initiative / Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NGI / NWO, 05040202 et 050 - 060-810 LPN), financé par l&#39;UE réseau d&#39;excellence Durée de vie (FP6 036894) et le Programme de recherche et d&#39;innovation orientée sur la génomique (SenterNovem; IGE01014 et IGE5007).

1. Construction des plasmides <ol><li> Afin personnalisé oligo-nucléotides codant pour dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) et pour dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) et le ligaturer dans le vecteur pEGFP-C1 afin d&#39;obtenir la fusion de la GFP avec dgn / dgnFS (figure 1). </li><li> Amplifier la séquence codant pour la GFP-dgn et GFP-dgnFS par PCR selon le protocole du kit de clonage TOPO directionnel pENTR et continuer avec le kit TOPO directionnel pLenti6/V5 clonage (figure 6). </li></o...

<ol>
	<li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes.">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).</li><li>Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+oxidized+proteins+by+the+20S+proteasome.">Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome.</a> Biochimi. 83, 301-310 (2001).</li><li>Stangl, K., Stangl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+and+endothelial+(dys)function.">The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function.</a> Cardiovasc. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+in+neuropathology.">The ubiquitin proteasome system in neuropathology.</a> Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).</li><li>Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Interplay+between+mitochondrial+and+proteasome+activity+in+skin+aging.">Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging.</a> J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).</li><li>Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+cellular+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+molecules:+role+in+cellular+senescence+and+aging.">Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).</li><li>Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+declines+in+proteasome+activity+in+the+heart.">Age-dependent declines in proteasome activity in the heart.</a> Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).</li><li>Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-lived+green+fluorescent+proteins+for+quantifying+ubiquitin/proteasome-dependent+proteolysis+in+living+cells.">Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).</li><li>Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+model+of+the+ubiquitin/proteasome+system.">A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system.</a> Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+desminopathy+mouse+hearts.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts.</a> FASEB J. 20, 362-364 (2006).</li><li>Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+dysfunction+in+a+polyglutamine+disease+model+occurs+in+the+absence+of+ubiquitin-proteasome+system+impairment+and+inversely+correlates+with+the+degree+of+nuclear+inclusion+formation.">Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).</li><li>Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+proteasome+active+site+allostery+as+revealed+by+subunit-specific+inhibitors.">Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors.</a> Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).</li><li>Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+ubiquitin-dependent+proteolysis+with+green+fluorescent+protein+substrates.">Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates.</a> Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).</li><li>Lener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+Nox4+restricts+the+replicative+lifespan+of+human+endothelial+cells.">The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.</a> Biochem. J. 423, 363-374 (2009).</li></ol>

La première publication en utilisant la protéine fluorescente verte (GFP) comme substrat reporter pour l&#39;activité ubiquitine-protéasome a été publié en 2000 12. Depuis lors, la GFP est devenu un outil commun de visualiser les activités cellulaires, en particulier le processus ubiquitine-protéasome. Pour surveiller l&#39;activité ubiquitine-protéasome in vivo d&#39;un modèle de souris transgénique avec un rapporteur GFP basée a été mis en place 13. Autres recherches<...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> pEGFP-C1 Vecteur </td><td> BD Bioscience Clontech </td><td> 6084-1 </td></tr><tr><td> pENTR Directional TOPO Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K2400-20 </td></tr><tr><td> pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> V496-10 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 réactif </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5546 </td></tr><tr><td> Filtre PVDF (Rotilabo-Spritzenfilter) </td><td> Roth </td><td> P667.1 </td></tr><tr><td> Polyéthylène glycol </td><td> Sigma </td><td> P2139 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Merck </td><td> 1.06404.1000 </td></tr><tr><td> Phosphate de Dulbecco tamponnée Saline 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> hexadiméthrine bromure de </td><td> Sigma </td><td> 10,768-9 </td></tr><tr><td> Blasticidine </td><td> Invitrogen </td><td> R21001 </td></tr><tr><td> Cristal violet </td><td> Sigma </td><td> C3886 </td></tr><tr><td> FACS tubes </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> La streptomycine Pénicilline (Pen-Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140130 </td></tr><tr><td> L-glutamine 200 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Sérum foetal bovin (FBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> MEM non-acides aminés essentiels (AANE) 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 11140035 </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium 100 mM MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11360039 </td></tr><tr><td> D-(+)-glucose (45%) </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Généticine </td><td> Invitrogen </td><td> 11811023 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Merck </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA (0,05%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td></tr></tbody></table>

monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein

Protéasome est la principale organite intracellulaire impliquée dans la dégradation protéolytique de la anormaux, mal repliées, les protéines endommagées ou oxydées 1, 2. Maintien de l&#39;activité du protéasome est impliqué dans de nombreux processus cellulaires clés, comme la réponse au stress cellulaire 3, la régulation du cycle cellulaire et de la différenciation cellulaire 4 ou en réponse du système immunitaire 5. Le dysfonctionnement du système ubiquitine-protéasome a été associée à l&#39;apparition de tumeurs et de maladies neurodégénératives 4, 6. En outre, une diminution de l&#39;activité du protéasome a été trouvé comme une caractéristique de la sénescence cellulaire et organismique vieillissement 7, 8, 9, 10. Ici, nous présentons une méthode pour mesurer l&#39;activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes en utilisant une protéine de fusion GFP-dgn. Pour être en mesure de surveiller l&#39;activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes primaires, construit d&#39;ADN complémentaire codant pour une protéine fluorescente verte (GFP)-dgn protéine de fusion (GFP-dgn, instable) et une variante portant une mutation du cadre de lecture (GFP-dgnFS, stable 11) sont insérés dans des vecteurs d&#39;expression lentiviral. Nous préférons cette technique par rapport aux techniques de transfection traditionnels, car il garantit une efficacité de transfection très élevée indépendamment du type de cellule ou de l&#39;âge du donateur. La différence entre la fluorescence émise par la GFP-dgnFS (stable) et la protéine déstabilisé (GFP-dgn) en l&#39;absence ou en présence de l&#39;inhibiteur de protéasome peuvent être utilisées pour estimer l&#39;activité ubiquitine-protéasome dans chaque souche cellulaire particulier. Ces différences peuvent être surveillés par microscopie à épifluorescence ou peut être mesurée par cytométrie en flux.

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Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Procédé pour surveiller l&#39;activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes est décrit. Un degron-GFP déstabilisée-(GFP-dgn) et une protéine de fusion GFP-stable dgnFS sont générés et transduites dans la cellule en utilisant un vecteur d&#39;expression lentiviral. Cette technique permet de générer une lignée stable de cellules exprimant GFP-dgn/GFP-dgnFS dans lequel l&#39;activité ubiquitine-protéasome peut être facilement évaluée en utilisant épifluorescence ou la cytométrie en flux.

Suivi de l&#39;activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes aide d&#39;un Degron (dgn)-déstabilisé Green Fluorescent Protein Reporter Protéines (GFP) à base de

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

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