Name: monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein
Uploaded: 2012-11-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי: רשת מחקר הלאומי להזדקנות (NFN S93) על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF), הנציבות האירופיות המשולב MiMAGE פרויקטים וPROTEOMAGE, הולנד ג&#39;נומיקס יוזמה / ארגון הולנד למחקר מדעי (NGI / NWO; 05040202 ו050 - 060-810 NCHA), האיחוד האירופי במימון רשת של אקסלנס תוחלת חיים (FP6 036894), וחדשנות תכנית מוכוונת מחקר על ג&#39;נומיקס (SenterNovem; IGE01014 וIGE5007).

1. בניית פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוליגו-נוקלאוטידים סדר המותאם אישית לקידוד DGN (11 ACKNWFSSLSHFVIHL) ולdgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) ולקשור אותו לוקטור pEGFP-C1 להשיג היתוך של GFP עם DGN / dgnFS (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את רצף הקידוד לGFP-DGN...

<ol>
	<li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes.">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).</li><li>Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+oxidized+proteins+by+the+20S+proteasome.">Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome.</a> Biochimi. 83, 301-310 (2001).</li><li>Stangl, K., Stangl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+and+endothelial+(dys)function.">The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function.</a> Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).</li><li>Tuoc, T. C., Stoykova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+ubiquitin-proteosome+system+in+neurogenesis.">Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).</li><li>Rock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+block+the+degradation+of+most+cell+proteins+and+the+generation+of+peptides+presented+on+MHC+class+I+molecules.">Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules.</a> Cell. 78, 761-771 (1994).</li><li>Lehman, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+in+neuropathology.">The ubiquitin proteasome system in neuropathology.</a> Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).</li><li>Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Interplay+between+mitochondrial+and+proteasome+activity+in+skin+aging.">Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging.</a> J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).</li><li>Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+cellular+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+molecules:+role+in+cellular+senescence+and+aging.">Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).</li><li>Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+declines+in+proteasome+activity+in+the+heart.">Age-dependent declines in proteasome activity in the heart.</a> Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).</li><li>Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+activity+in+skeletal+muscle:+A+matter+of+assay+design,+muscle+type,+and+age.">Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age.</a> Anal. Biochem. , (2009).</li><li>Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li><li>Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-lived+green+fluorescent+proteins+for+quantifying+ubiquitin/proteasome-dependent+proteolysis+in+living+cells.">Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).</li><li>Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+model+of+the+ubiquitin/proteasome+system.">A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system.</a> Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+desminopathy+mouse+hearts.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts.</a> FASEB J. 20, 362-364 (2006).</li><li>Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+dysfunction+in+a+polyglutamine+disease+model+occurs+in+the+absence+of+ubiquitin-proteasome+system+impairment+and+inversely+correlates+with+the+degree+of+nuclear+inclusion+formation.">Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).</li><li>Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+proteasome+active+site+allostery+as+revealed+by+subunit-specific+inhibitors.">Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors.</a> Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).</li><li>Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+ubiquitin-dependent+proteolysis+with+green+fluorescent+protein+substrates.">Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates.</a> Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).</li><li>Lener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+Nox4+restricts+the+replicative+lifespan+of+human+endothelial+cells.">The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.</a> Biochem. J. 423, 363-374 (2009).</li></ol>

הפרסום הראשון באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמצע לפעילות כתב היוביקוויטין-הפרוטאזום פורסם בשנת 2000 12. מאז, GFP הפך לכלי נפוץ לדמיין פעילות הסלולר, במיוחד בתהליך היוביקוויטין-הפרוטאזום. כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום in vivo במודל עכבר מהונדס ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> וקטור pEGFP-C1 </td><td> BD Clontech Bioscience </td><td> 6084-1 </td></tr><tr><td> pENTR יווני topo שיבוט הקיט </td><td> Invitrogen </td><td> K2400-20 </td></tr><tr><td> ערכת שיבוט topo יווני pLenti6/V5 </td><td> Invitrogen </td><td> V496-10 </td></tr><tr><td> מגיב Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> סיגמא </td><td> D5546 </td></tr><tr><td> PVDF המסנן (Rotilabo-Spritzenfilter) </td><td> רוט </td><td> P667.1 </td></tr><tr><td> פוליאתילן גליקול </td><td> סיגמא </td><td> P2139 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> מרק </td><td> 1.06404.1000 </td></tr><tr><td> פוספט של Dulbecco Buffered סאליne 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> hexadimethrine רומיד </td><td> סיגמא </td><td> 10,768-9 </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invitrogen </td><td> R21001 </td></tr><tr><td> קריסטל סגול </td><td> סיגמא </td><td> C3886 </td></tr><tr><td> FACS צינורות </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> סטרפטומיצין פניצילין (עט-דלקת) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140130 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין 200 מ&quot;מ </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> עוברי בסרום שור (FBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות ממ (NEAA) 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 11140035 </td></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ פירובט נתרן MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11360039 </td></tr><tr><td> D-(+)-גלוקוז (45%) </td><td> סיגמא </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Geneticin </td><td> Invitrogen </td><td> 11811023 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> מרק </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> סיגמא </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA (0.05%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td></tr></tbody></table>

monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein

הפרוטאזום הוא אברון התאי העיקרי מעורב בפירוק החלבונים של חלבונים, לא תקינים, misfolded פגום או מתחמצנים 1, 2. תחזוקה של פעילות הפרוטאזום הייתה מעורבת בתהליכים תאיים חשובים רבים, כמו תגובתו של תא לחץ 3, רגולצית מחזור תא והתמיינות תאי 4 או בתגובה של מערכת חיסון 5. התפקוד הלקוי של מערכת היוביקוויטין-הפרוטאזום כבר קשור להתפתחות של גידולים ומחלות ניווניות 4, 6. בנוסף, ירידה בפעילות הפרוטאזום נמצאה כתכונה של הזדקנות תאית והאורגניזם 7 הזדקנות, 8, 9, 10. כאן, אנו מציגים שיטה למדידת פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים באמצעות חלבון היתוך GFP-DGN. כדי להיות מסוגלת לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים ראשוניים, הדנ&quot;א משלים בונה מקודד חלבון היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) DGN-(GFP-DGN, לא יציב) וריאנט נושא מוטצית frameshift (GFP-dgnFS, 11 יציבים) מוכנסים בוקטורי הביטוי lentiviral. אנחנו מעדיפים טכניקה זו על טכניקות מסורתיות transfection כי זה מבטיח יעילות transfection גבוהה מאוד תלוי בסוג התא או גילו של התורם. ההבדל בין פלואורסצנטי מוצג על ידי GFP-dgnFS (יציב) החלבון והחלבון המעורער (GFP-DGN) בהעדר או הנוכחות של מעכבי הפרוטאזום ניתן להשתמש כדי להעריך את פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בכל מתח תא מסוים. הבדלים אלה יכולים להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ epifluorescence או ניתן למדוד על ידי cytometry זרימה.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein at JoVE.com

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

שיטה כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים מתוארת. Degron-מעורער GFP-(GFP-DGN) וחלבון היתוך יציב GFP-dgnFS נוצר וtransduced לתוך התא באמצעות וקטור ביטוי lentiviral. טכניקה זו מאפשרת ליצור קו יציב GFP-dgn/GFP-dgnFS להביע תא שבו פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום ניתן להעריך בקלות באמצעות epifluorescence או cytometry זרימה.

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...