Name: monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein
Uploaded: 2012-11-10T14:00:00
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इस अध्ययन के द्वारा वित्त पोषित किया गया था: ऑस्ट्रियाई विज्ञान फाउंडेशन (FWF), यूरोपीय आयोग एकीकृत परियोजनाएं MiMAGE और PROTEOMAGE, नीदरलैंड जीनोमिक्स पहल द्वारा एजिंग (S93 NFN) पर राष्ट्रीय अनुसंधान नेटवर्क / वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (एनजीआई NWO / 05040202 और 050 - 060-810) NCHA, यूरोपीय संघ के नेटवर्क उत्कृष्टता जीवनकाल (036,894) FP6 वित्त पोषित, और अभिनव जीनोमिक्स पर उन्मुख अनुसंधान कार्यक्रम (SenterNovem, IGE01014 और IGE5007).

1. प्लास्मिड निर्माण <ol><li> DGN (11 ACKNWFSSLSHFVIHL) के लिए और dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) के लिए आदेश कस्टम एन्कोडिंग oligo-nucleotides और यह pEGFP-C1 वेक्टर में कटी घमनी को बांधना / DGN dgnFS (1 चित्रा) के साथ GFP की संलयन प्राप्त करने के. </li><li> पीसीआर के प्...

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	<li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes.">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).</li><li>Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+oxidized+proteins+by+the+20S+proteasome.">Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome.</a> Biochimi. 83, 301-310 (2001).</li><li>Stangl, K., Stangl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+and+endothelial+(dys)function.">The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function.</a> Cardiovasc. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+in+neuropathology.">The ubiquitin proteasome system in neuropathology.</a> Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).</li><li>Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Interplay+between+mitochondrial+and+proteasome+activity+in+skin+aging.">Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging.</a> J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).</li><li>Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+cellular+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+molecules:+role+in+cellular+senescence+and+aging.">Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).</li><li>Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+declines+in+proteasome+activity+in+the+heart.">Age-dependent declines in proteasome activity in the heart.</a> Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).</li><li>Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. 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Biotechnol. 21, 897-902 (2003).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+desminopathy+mouse+hearts.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts.</a> FASEB J. 20, 362-364 (2006).</li><li>Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+dysfunction+in+a+polyglutamine+disease+model+occurs+in+the+absence+of+ubiquitin-proteasome+system+impairment+and+inversely+correlates+with+the+degree+of+nuclear+inclusion+formation.">Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation.</a> Hum. Mol. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+ubiquitin-dependent+proteolysis+with+green+fluorescent+protein+substrates.">Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates.</a> Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).</li><li>Lener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+Nox4+restricts+the+replicative+lifespan+of+human+endothelial+cells.">The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.</a> Biochem. J. 423, 363-374 (2009).</li></ol>

1 ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि के लिए एक संवाददाता सब्सट्रेट के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का उपयोग प्रकाशन 12 2000 में प्रकाशित किया गया था. तब से, GFP सेलुलर गतिविधियों, विशेष रूप से ubiquitin-एंटीबॉडी प्रक्रि?...

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td></tr><tr><td> pEGFP-C1 वेक्टर </td><td> बायोसाइंस Clontech BD </td><td> 6084-1 </td></tr><tr><td> pENTR दिशात्मक Topo क्लोनिंग किट </td><td> Invitrogen </td><td> K2400-20 </td></tr><tr><td> pLenti6/V5 दिशात्मक Topo क्लोनिंग किट </td><td> Invitrogen </td><td> V496-10 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 अभिकर्मक </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> सिग्मा </td><td> D5546 </td></tr><tr><td> PVDF फिल्टर (Rotilabo - Spritzenfilter) </td><td> Roth </td><td> P667.1 </td></tr><tr><td> Polyethylene glycol </td><td> सिग्मा </td><td> P2139 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> मर्क </td><td> 1.06404.1000 </td></tr><tr><td> Dulbecco फास्फेट साली Bufferedपूर्वोत्तर 1x (पीबीएस) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> hexadimethrine ब्रोमाइड </td><td> सिग्मा </td><td> 10,768-9 </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invitrogen </td><td> R21001 </td></tr><tr><td> क्रिस्टल बैंगनी </td><td> सिग्मा </td><td> C3886 </td></tr><tr><td> FACS ट्यूबों </td><td> बी.डी. बायोसाइंसेज </td><td></td></tr><tr><td> पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140130 </td></tr><tr><td> एल glutamine 200 मिमी </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) </td><td> Biochrom एजी </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड 100x (NEAA) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140035 </td></tr><tr><td> सदस्य सोडियम पाइरूवेट 100 मिमी </td><td> Invitrogen </td><td> 11360039 </td></tr><tr><td> डी (+) ग्लूकोज (45%) </td><td> सिग्मा </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Geneticin </td><td> Invitrogen </td><td> 11811023 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> मर्क </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> सिग्मा </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> ट्रिप्सिन EDTA (0.05%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td></tr></tbody></table>

monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein

एंटीबॉडी मुख्य intracellular organelle असामान्य, misfolded, क्षतिग्रस्त या ऑक्सीकरण हो जाता है 1 प्रोटीन, 2 की गिरावट proteolytic में शामिल है. सेल तनाव 3 प्रतिक्रिया, कोशिका चक्र विनियमन और सेलुलर भेदभाव 4 या प्रतिरक्षा प्रणाली जवाब में 5 की तरह, एंटीबॉडी गतिविधि के रखरखाव में कई महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में फंसा था. ubiquitin-एंटीबॉडी प्रणाली की शिथिलता ट्यूमर और neurodegenerative रोगों के 4, 6 के विकास के लिए संबंधित दिया गया है. इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी गतिविधि में एक कमी सेलुलर senescence और organismal उम्र बढ़ने के 7, 8, 9, 10 की एक विशेषता के रूप में पाया गया था. यहाँ, हम रहने वाले एक GFP-DGN संलयन प्रोटीन का उपयोग कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी की गतिविधि को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. प्राथमिक जीवित कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी की गतिविधि पर नजर रखने में सक्षम हो सकता है, पूरक डीएनए एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) DGN संलयन प्रोटीन के लिए कोडिंग constructs (GFPDGN, अस्थिर) और एक एक frameshift उत्परिवर्तन (GFP dgnFS, 11 स्थिर) ले जाने variant lentiviral अभिव्यक्ति वैक्टर में डाला जाता है. हम पारंपरिक अभिकर्मक तकनीकों पर इस तकनीक को पसंद करते हैं, क्योंकि यह एक बहुत ही उच्च अभिकर्मक दक्षता की गारंटी देता है सेल प्रकार या दाता की उम्र के स्वतंत्र. (स्थिर) GFP-dgnFS प्रोटीन और या एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला की अनुपस्थिति में अस्थिर प्रोटीन (GFP DGN) द्वारा प्रदर्शित प्रतिदीप्ति के बीच अंतर करने के लिए एक विशेष सेल तनाव में ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन मतभेदों epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकता है या cytometry प्रवाह से मापा जा सकता है.

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Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Ubiquitin-एंटीबॉडी जीवित कोशिकाओं में गतिविधि पर नजर रखने के लिए एक विधि का वर्णन है. एक degron अस्थिर GFP (GFP-DGN) और एक स्थिर GFP-dgnFS संलयन प्रोटीन उत्पन्न कर रहे हैं और एक lentiviral अभिव्यक्ति वेक्टर का उपयोग सेल में transduced. इस तकनीक के लिए एक स्थिर GFP-dgn/GFP-dgnFS व्यक्त सेल लाइन में जो ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि epifluorescence या प्रवाह cytometry का उपयोग आसानी से किया जा मूल्यांकन कर सकते हैं उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है.

जीवित कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि की निगरानी एक Degron (DGN) अस्थिर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर (GFP) आधारित प्रोटीन का उपयोग

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

कार्बनिक सॉल्वेंट और एसिटिक एसिड के बिना जी 250 Coomassie के साथ जैल में प्रोटीन की धुंधला

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

आण्विक Fractionation वजन के आधार के लिए तरल चरण रिकवरी के साथ GELFREE 8100 Fractionation प्रणाली का उपयोग

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular प्याज जीन Helios गन का उपयोग कक्ष में प्रतिदीप्ति complementation (BiFC) प्रोटीन प्रोटीन सहभागिता के लिए परख

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Assays (FRAP और फ्लिप) photobleaching भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में रहते हैं chromatin प्रोटीन गतिशीलता उपाय

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

में निगरानी प्रोटीन refolding के लिए युग्मित Assays<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण का प्रयोग जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच कर

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में जैविक रास्ते की Ubiquitin और ubiquitin की तरह सिस्टम नियामकों की पहचान siRNA स्क्रीनिंग

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

प्रोटीन गिरावट के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए रिपोर्टर-आधारित विकास परख

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-टुकड़ा complementation परख (पीसीए) द्वारा जीनोम चौड़ा प्रोटीन प्रोटीन सहभागिता स्क्रीनिंग

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

झिल्ली प्रोटीन की हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग में<em&gt; Escherichia कोलाई</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...