Name: monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein
Uploaded: 2012-11-10T14:00:00
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Este estudo foi financiado por: Rede Nacional de Pesquisa do Envelhecimento (NFN S93) pelo austríaco Science Foundation (FWF), Comissão Europeia e projetos integrados de mimage PROTEOMAGE, Holanda Genomics Initiative / Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NGI / NWO; 05040202 e 050 - 060-810 NCHA), a UE financiou Rede de Excelência Longevidade (FP6 036.894), Programa de Pesquisa e Inovação Orientada em Genômica (SenterNovem; IGE01014 e IGE5007).

1. Construção do plasmídeo <ol><li> Ordem personalizada codificação oligonucleótidos para dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) e para dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) e ligar-lo para o vector pEGFP-C1 para obter a fusão da GFP com dgn / dgnFS (Figura 1). </li><li> Amplificar a sequência que codifica para GFP-dgn e GFP-dgnFS por PCR de acordo com o protocolo do kit de clonagem TOPO pENTR direccional e continuar com o pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (Figura 6). </li></ol><p cla...

<ol>
	<li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes.">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).</li><li>Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+oxidized+proteins+by+the+20S+proteasome.">Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome.</a> Biochimi. 83, 301-310 (2001).</li><li>Stangl, K., Stangl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+and+endothelial+(dys)function.">The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function.</a> Cardiovasc. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+in+neuropathology.">The ubiquitin proteasome system in neuropathology.</a> Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).</li><li>Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Interplay+between+mitochondrial+and+proteasome+activity+in+skin+aging.">Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging.</a> J. Invest. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+ubiquitin-dependent+proteolysis+with+green+fluorescent+protein+substrates.">Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates.</a> Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).</li><li>Lener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+Nox4+restricts+the+replicative+lifespan+of+human+endothelial+cells.">The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.</a> Biochem. J. 423, 363-374 (2009).</li></ol>

A primeira publicação utilizando a proteína fluorescente verde (GFP) como substrato repórter para a actividade de ubiquitina-proteassoma, foi publicado em 2000 12. Desde então, a GFP tem sido uma ferramenta comum para visualizar as actividades celulares, especialmente o processo de ubiquitina-proteassoma. Para monitorar a ubiquitina-proteassoma actividade in vivo num modelo de ratinho transgénico com um repórter GFP baseada foi introduzido 13. Também, em pesquisa in vi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> pEGFP-C1 Vector </td><td> BD Bioscience Clontech </td><td> 6084-1 </td></tr><tr><td> pENTR Direcional TOPO Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K2400-20 </td></tr><tr><td> pLenti6/V5 Direcional TOPO Kit Clonagem </td><td> Invitrogen </td><td> V496-10 </td></tr><tr><td> Lipofectamine Reagente 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5546 </td></tr><tr><td> PVDF filtro (Rotilabo-Spritzenfilter) </td><td> Roth </td><td> P667.1 </td></tr><tr><td> Polietileno glicol </td><td> Sigma </td><td> P2139 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Merck </td><td> 1.06404.1000 </td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco tamponada Saline 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hexadimetrina brometo </td><td> Sigma </td><td> 10,768-9 </td></tr><tr><td> Blasticidina </td><td> Invitrogen </td><td> R21001 </td></tr><tr><td> O violeta de cristal </td><td> Sigma </td><td> C3886 </td></tr><tr><td> FACS tubos </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina, estreptomicina (Pen-Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140130 </td></tr><tr><td> L-glutamina 200 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino (FBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> MAM não-aminoácidos essenciais (NEAA) 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 11140035 </td></tr><tr><td> MEM de piruvato de sódio 100 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 11360039 </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucose (45%) </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Geneticina </td><td> Invitrogen </td><td> 11811023 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Merck </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,05%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td></tr></tbody></table>

monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein

Proteassoma é o principal organelo intracelular envolvida na degradação proteolítica da anormais, deformadas, proteínas danificadas ou oxidadas 1, 2. Manutenção da atividade do proteassoma foi implicado em vários processos celulares, como resposta celular ao estresse 3, regulação do ciclo celular e diferenciação celular em 4 ou 5 resposta do sistema imunológico. A disfunção do sistema ubiquitina-proteassoma tem sido relacionado com o desenvolvimento de tumores e doenças neurodegenerativas 4, 6. Além disso, a diminuição da actividade do proteassoma foi encontrada como uma característica de senescência celular e envelhecimento organismal 7, 8, 9, 10. Aqui, apresentamos um método para medir a atividade da ubiquitina-proteassoma em células vivas usando uma proteína de fusão GFP-dgn. Para ser capaz de monitorizar actividade de ubiquitina-proteassoma nas células vivas primárias, constrói DNA complementar que codifica para uma proteína fluorescente verde (GFP), proteína de fusão dgn (GFP-dgn, instável) e uma variante de realização de uma mutação frameshift (GFP-dgnFS, estável 11) são inseridos em vectores de expressão lentiviral. Nós preferimos desta técnica em relação às técnicas tradicionais de transfecção, porque garante uma eficiência de transfecção elevada, independentemente do tipo de célula ou a idade do dador. A diferença entre a fluorescência exibida pelo GFP-dgnFS (estável) da proteína e da proteína desestabilizado (GFP-dgn) na ausência ou na presença de inibidor de proteassoma podem ser utilizados para estimar a actividade de ubiquitina-proteassoma em cada linhagem celular particular. Estas diferenças podem ser monitorizadas através de microscopia de epifluorescência, ou pode ser medido por citometria de fluxo.

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Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Um método para monitorizar a actividade de ubiquitina-proteassoma nas células vivas é descrito. A degron-GFP-desestabilizado (GFP-dgn) e uma proteína de fusão GFP estável dgnFS-são gerados e transduzidos para a célula utilizando um vector de expressão lentiviral. Esta técnica permite a geração de um estábulo GFP-dgn/GFP-dgnFS linha celular que expressa em que a actividade de ubiquitina-proteassoma podem ser facilmente avaliados utilizando epifluorescência ou citometria de fluxo.

Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

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Biologia

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