Name: monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein
Uploaded: 2012-11-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein at JoVE.com

Este estudio fue financiado por: Red Nacional de Investigación sobre el Envejecimiento (NFN S93) por la Fundación de Ciencias de Austria (FMF), Comisión Europea Integrada de Proyectos y MiMAGE PROTEOMAGE, Países Bajos Genómica Iniciativa / Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (IGN / NWO, 05040202 y 050 - 060-810 NCHA), financiado por la UE Red de Excelencia Duración (6 º PM 036.894) y el Programa de Innovación Tecnológica Orientada sobre Genómica (SenterNovem; IGE01014 y IGE5007).

1. Construcción de plásmidos <ol><li> Orden de ratón oligo-nucleótidos que codifica para dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) y para dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) y ligarlo en el vector pEGFP-C1 para obtener la fusión de la GFP con dgn / dgnFS (Figura 1). </li><li> Amplificar la secuencia codificante de GFP y GFP-dgn dgnFS-por PCR de acuerdo con el protocolo del kit de clonación pENTR Directional TOPO y continuar con la pLenti6/V5 direccional TOPO Cloning Kit (Figura 6). </li></ol><...

<ol>
	<li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes.">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).</li><li>Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+oxidized+proteins+by+the+20S+proteasome.">Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome.</a> Biochimi. 83, 301-310 (2001).</li><li>Stangl, K., Stangl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+and+endothelial+(dys)function.">The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function.</a> Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).</li><li>Tuoc, T. C., Stoykova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+ubiquitin-proteosome+system+in+neurogenesis.">Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).</li><li>Rock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+block+the+degradation+of+most+cell+proteins+and+the+generation+of+peptides+presented+on+MHC+class+I+molecules.">Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules.</a> Cell. 78, 761-771 (1994).</li><li>Lehman, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+in+neuropathology.">The ubiquitin proteasome system in neuropathology.</a> Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).</li><li>Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Interplay+between+mitochondrial+and+proteasome+activity+in+skin+aging.">Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging.</a> J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).</li><li>Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+cellular+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+molecules:+role+in+cellular+senescence+and+aging.">Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).</li><li>Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+declines+in+proteasome+activity+in+the+heart.">Age-dependent declines in proteasome activity in the heart.</a> Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).</li><li>Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+activity+in+skeletal+muscle:+A+matter+of+assay+design,+muscle+type,+and+age.">Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age.</a> Anal. Biochem. , (2009).</li><li>Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li><li>Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-lived+green+fluorescent+proteins+for+quantifying+ubiquitin/proteasome-dependent+proteolysis+in+living+cells.">Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).</li><li>Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+model+of+the+ubiquitin/proteasome+system.">A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system.</a> Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+desminopathy+mouse+hearts.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts.</a> FASEB J. 20, 362-364 (2006).</li><li>Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+dysfunction+in+a+polyglutamine+disease+model+occurs+in+the+absence+of+ubiquitin-proteasome+system+impairment+and+inversely+correlates+with+the+degree+of+nuclear+inclusion+formation.">Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).</li><li>Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+proteasome+active+site+allostery+as+revealed+by+subunit-specific+inhibitors.">Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors.</a> Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).</li><li>Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+ubiquitin-dependent+proteolysis+with+green+fluorescent+protein+substrates.">Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates.</a> Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).</li><li>Lener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+Nox4+restricts+the+replicative+lifespan+of+human+endothelial+cells.">The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.</a> Biochem. J. 423, 363-374 (2009).</li></ol>

La primera publicación utilizando la proteína fluorescente verde (GFP) como sustrato reportero de ubiquitina-proteasoma actividad se publicó en 2000 12. Desde entonces, GFP se ha convertido en una herramienta común para visualizar las actividades celulares, especialmente el proceso de ubiquitina-proteasoma. Para supervisar la ubiquitina-proteasoma actividad in vivo de un modelo de ratón transgénico con un reportero GFP basada ha introducido 13. Adicional a la investigación ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> pEGFP-C1 Vector </td><td> BD Bioscience Clontech </td><td> 6084-1 </td></tr><tr><td> pENTR Directional TOPO Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K2400-20 </td></tr><tr><td> pLenti6/V5 direccional TOPO Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> V496-10 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5546 </td></tr><tr><td> PVDF filtro (Rotilabo-Spritzenfilter) </td><td> Roth </td><td> P667.1 </td></tr><tr><td> Polietileno glicol </td><td> Sigma </td><td> P2139 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Merck </td><td> 1.06404.1000 </td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco tamponada Saline 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> hexadimetrina bromuro </td><td> Sigma </td><td> 10,768-9 </td></tr><tr><td> Blasticidina </td><td> Invitrogen </td><td> R21001 </td></tr><tr><td> El cristal violeta </td><td> Sigma </td><td> C3886 </td></tr><tr><td> FACS tubos </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina estreptomicina (Pen-Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140130 </td></tr><tr><td> L-glutamina 200 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal (FBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> MEM no aminoácidos esenciales (AANE) 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 11140035 </td></tr><tr><td> MEM piruvato sódico 100 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 11360039 </td></tr><tr><td> D-(+)-glucosa (45%) </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Geneticina </td><td> Invitrogen </td><td> 11811023 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Merck </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,05%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td></tr></tbody></table>

monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (gfp)-based reporter protein

Proteasoma es el principal organelo intracelular implicada en la degradación proteolítica de proteínas anormales, mal dobladas, dañadas u oxidadas 1, 2. El mantenimiento de la actividad del proteasoma fue implicado en muchos procesos celulares clave, como respuesta al estrés celular 3, la regulación del ciclo celular y la diferenciación celular 4 o en la respuesta del sistema inmune 5. La disfunción del sistema ubiquitina-proteasoma se ha relacionado con el desarrollo de tumores y enfermedades neurodegenerativas 4, 6. Además, una disminución en la actividad del proteasoma se encontró como una característica de la senescencia celular y el envejecimiento organismal 7, 8, 9, 10. A continuación, se presenta un método para medir la actividad ubiquitina-proteasoma en células vivas utilizando una proteína de fusión GFP-dgn. Para ser capaz de controlar la actividad de la ubiquitina-proteasoma en células vivas primarias, ADN complementario construye codifica para una proteína fluorescente verde (GFP)-dgn proteína de fusión (GFP-dgn, inestable) y una variante con una mutación de desplazamiento de marco (GFP-dgnFS, estable 11) se insertan en vectores de expresión lentiviral. Se prefiere esta técnica sobre técnicas de transfección tradicionales, ya que garantiza una eficacia de transfección muy alta independiente del tipo de célula o de la edad del donante. La diferencia entre la fluorescencia mostrada por el GFP-dgnFS (estable) de proteína y la proteína de desestabilizado (GFP-dgn) en ausencia o presencia de inhibidor del proteasoma puede ser utilizado para estimar la ubiquitina-proteasoma actividad en cada cepa de célula particular. Estas diferencias pueden ser supervisado por microscopía de epifluorescencia o puede ser medido por citometría de flujo.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein at JoVE.com

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Un método para supervisar la actividad de ubiquitina-proteasoma en células vivas se describe. Un degron-GFP desestabilizado-(GFP-dgn) y una estable GFP-dgnFS proteína de fusión se generan y se transduce en la célula usando un vector de expresión lentiviral. Esta técnica permite generar un GFP-dgn/GFP-dgnFS estable línea celular que expresa en la que se puede ubiquitina-proteasoma actividad fácilmente evaluada utilizando epifluorescencia o citometría de flujo.

Control de la ubiquitina-proteasoma actividad en las células vivas utilizando un degron (dgn)-desestabilizado la proteína verde fluorescente (GFP)-basada en proteína indicadora

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Ensayo de crecimiento basado en reportero para el Análisis Sistemático de la degradación de proteínas

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...